官紹年，陳迎珠，卓明磊，賈淑芹，王國洪，徐國賓,c(1.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所 a.檢驗(yàn)科，b.胸部腫瘤內(nèi)一科，c.分子診斷中心&惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100142；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400010 )

2018年全球新增肺癌210萬例(11.6%)，死亡180萬例(18.4%)，是全球發(fā)病率和致死率最高的癌癥[1]。中國是肺癌高發(fā)國家，據(jù)2019年國家癌癥中心《2015年中國惡性腫瘤流行病情況分析》數(shù)據(jù)顯示，中國人群中肺癌是男性發(fā)病率最高的腫瘤，在女性腫瘤中發(fā)病率排名第二[2]。值得注意的是，中國女性肺癌發(fā)病率(22.8/100 000)高于全球其他國家女性肺癌發(fā)病率[1]。非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的類型，占約80%～85%。由于缺乏早期典型癥狀和可篩查手段，大多數(shù)肺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，經(jīng)化療等標(biāo)準(zhǔn)治療方案的肺癌患者5年生存率僅為15%。

酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKI)是通過在細(xì)胞內(nèi)與ATP競爭性結(jié)合表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，簡稱為EGFR、ErbB-1或HER1)基因上酪氨酸激酶域的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷EGFR分子內(nèi)酪氨酸自身磷酸化及活化，從而抑制EGFR信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)[3-4]表明基于EGFR基因的靶向治療在EGFR敏感突變陽性的晚期NSCLC患者中可改善其生存及預(yù)后。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national comprehensive cancer network，NCCN)2019年V2版《非小細(xì)胞肺癌診治指南》提出：所有NSCLC患者均應(yīng)檢測(cè)EGFR基因。EGFR是NSCLC中的主要突變基因，突變率為46%。NSCLC患者中2種常見EGFR突變類型是19號(hào)外顯子缺失突變和21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變，在EGFR突變陽性人群中占比90%。這2種突變均可導(dǎo)致酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的活化，與TKI的敏感性相關(guān)，因此被稱為EGFR敏感突變。亞裔NSCLC患者人群EGFR基因敏感突變陽性率為50%，遠(yuǎn)高于白種人群[5]。大多數(shù)EGFR敏感突變來自非吸煙或既往輕度吸煙的腺癌患者，但是這些臨床特征不能用于選擇適合EGFR檢測(cè)的人群。目前國內(nèi)臨床中已常規(guī)開展EGFR基因的檢測(cè)，并將其作為靶向藥物治療的必要條件。本文將對(duì)EGFR基因突變類型、臨床應(yīng)用進(jìn)展及其檢測(cè)時(shí)需注意的問題作一總結(jié)。

1 EGFR基因結(jié)構(gòu)及NSCLC患者突變類型

EGFR基因位于第7號(hào)染色體p12-q22區(qū)上，包括28個(gè)外顯子區(qū)域。表達(dá)的蛋白質(zhì)分布于人類角質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞膜外表，包括胞外功能區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。主要調(diào)控的信號(hào)通路途徑包括：RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路、PLC-γ通路、PI3K-PDK通路和JAK-STAT通路。EGFR基因過表達(dá)時(shí)在腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡抑制發(fā)揮作用。

與NSCLC相關(guān)的EGFR基因突變主要集中在酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)區(qū)域的18～21號(hào)外顯子上，包括30余種突變(圖1)。18號(hào)外顯子突變占EGFR突變的3%～5%，常見的點(diǎn)突變?yōu)镚719X、E709X，常見缺失突變是del E709_T710insX。19號(hào)外顯子突變類型包括缺失突變、框內(nèi)插入突變、L747位點(diǎn)突變和D761Y點(diǎn)突變和其他少見突變等。19外顯子缺失突變(19del)在NSCLC中占比最多，約占EGFR基因突變的45%。19del已知的缺失突變類型有30余種，最常見的有p.E746_A750 del，目前擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，AMRS)的檢測(cè)試劑盒最多能檢測(cè)到29種缺失突變類型。其次，21號(hào)外顯子上L858R突變也是NSCLC患者EGFR基因的主要突變類型，約占EGFR突變的40%左右。L858R突變點(diǎn)在mRNA上的2 553位密碼子(T>C)，基因編碼的第858個(gè)氨基酸由亮氨酸(L)變成精氨酸(R)。除此以外，21號(hào)外顯子上還有L861位點(diǎn)突變、T854A點(diǎn)突變及其他少見突變。20外顯子突變類型有框內(nèi)重復(fù)/插入突變、T790M點(diǎn)突變、S768I點(diǎn)突變、C797S/G點(diǎn)突變及其他突變。其中框內(nèi)重復(fù)/插入突變是除19del、L858R外突變率最高的類型，90%以上的插入點(diǎn)位于Ser768和Val774之間。T790M突變是第790位密碼子的蘇氨酸(T)被蛋氨酸(M)替代，導(dǎo)致EGFRTK區(qū)域與靶向TKI藥物的親和力降低從而產(chǎn)生耐藥。T790M突變可用于監(jiān)測(cè)NSCLC患者EGFR-TKI治療耐藥情況，50%的獲得性耐藥患者可出現(xiàn)T790M突變，在評(píng)估NSCLC患者靶向治療療效和預(yù)后中存在重要價(jià)值[6]。

圖1EGFR基因結(jié)構(gòu)及主要突變類型示意圖

2 EGFR基因突變檢測(cè)的臨床價(jià)值

2.1指導(dǎo)晚期NSCLC患者TKI藥物的使用EGFR基因是NSCLC患者的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的驅(qū)動(dòng)基因，在Ⅰ期腫瘤中突變率為57.6%，Ⅱ期腫瘤中突變率為47.9%，在Ⅲ期腫瘤中突變率為47.5%，在Ⅳ期腫瘤中突變率為43.4%[7]。目前NSCLC患者EGFR突變檢測(cè)以組織病理學(xué)活檢作為金標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)組織EGFR突變檢測(cè)為陽性的NSCLC患者接受吉非替尼治療后無進(jìn)展生存(progression free survival，PFS)時(shí)間和總生存(overall survival，OS)時(shí)間較EGFR野生型患者延長，而EGFR野生型患者使用EGFR-TKI治療的效果則差于化療，提示組織EGFR檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)NSCLC患者的TKI治療的必要性[8]。Wang等[9]的Benefit研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織和血漿檢測(cè)的一致性為78.0%，血漿EGFR檢測(cè)敏感性和特異性分別為70.0%和93.9%，且血漿EGFR突變陽性的患者經(jīng)一代TKI治療后PFS時(shí)間延長，提出血漿EGFR的檢測(cè)也可用于指導(dǎo)TKI藥物的治療。Weber等[10]的研究同樣說明了外周血在篩選TKI治療獲益人群中的應(yīng)用價(jià)值：Ⅱ～Ⅳ期NSCLC患者血漿EGFR突變陽性患者經(jīng)厄洛替尼治療后PFS期較野生型患者延長(5.7個(gè)月vs 2.8個(gè)月)。綜上，組織或血漿中EGFR突變狀態(tài)均對(duì)指導(dǎo)NSCLC患者TKI治療至關(guān)重要。

(1)EGFR突變檢測(cè)陽性的晚期NSCLC患者TKI靶向治療效果優(yōu)于化療

化療是EGFR突變檢測(cè)陽性的NSCLC患者的傳統(tǒng)治療方案，但是臨床中化療的毒副作用多，如肝功能損害、惡心嘔吐、血小板減少等。迄今為止，國內(nèi)外已發(fā)表了多項(xiàng)比較這2種治療方法在組織EGFR突變檢測(cè)陽性的晚期NSCLC患者中療效的大型Ⅲ期臨床試驗(yàn)(表1)。結(jié)果顯示，EGFR突變陽性的晚期患者經(jīng)EGFR-TKI靶向治療后較化療的PFS期延長，客觀緩解率(objective response rate，ORR)提高，但OS期與化療相比差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此晚期NSCLC患者應(yīng)檢測(cè)EGFR，并對(duì)檢測(cè)陽性的患者行TKI靶向治療。若治療后未出現(xiàn)疾病進(jìn)展則行維持治療；若治療后出現(xiàn)進(jìn)展則再行后續(xù)全身治療。

表1 EGFR-TKI藥物和化療用于組織EGFR陽性NSCLC患者的治療效果比較

注：1*,18～21號(hào)外顯子上29種突變?nèi)我?種；2*,非常見突變,包括T790M、20號(hào)外顯子缺失、 G719X、S768I和L861Q等。

(2)指導(dǎo)組織EGFR檢測(cè)為敏感突變陽性的NSCLC患者從不同代一線TKI治療中獲益

2019年第2版NCCN《非小細(xì)胞肺癌診治指南》推薦經(jīng)EGFR基因敏感突變檢測(cè)陽性的初治NSCLC患者，應(yīng)給予一線EGFR-TKI藥物治療并定期評(píng)估療效。一線TKI治療藥物主要包括3代。第1代藥物有吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(elotinib)、埃克替尼(icotinib)、達(dá)克替尼(dacomitinib)及阿法替尼(afatinib)等，其中前3種已在中國批準(zhǔn)上市。?？颂婺崾俏覈灾餮邪l(fā)的EGFR-TKI藥物，2014年獲中國食品藥品監(jiān)督管理局(china food and grug administration，CFDA)批準(zhǔn)用于一線治療EGFR敏感基因突變NSCLC患者。其在1項(xiàng)Ⅳ期臨床研究[4]中治療EGFR敏感基因突變的NSCLC患者的ORR和疾病控制率 (disease control rate，DCR) 分別為56.3%和95.1%。吉非替尼與?？颂婺嵊糜贓GFR敏感的NSCLC患者的PFS時(shí)間和OS時(shí)間相當(dāng)[22]，與厄洛替尼的PFS時(shí)間也無差異(8.3個(gè)月vs 10個(gè)月，P=0.424)[23]，因此這3種一代TKI藥物對(duì)EGFR敏感突變的NSCLC患者的療效差異不大。阿法替尼和達(dá)克替尼是第2代不可逆性EGFR-TKI藥物。阿法替尼在LUX-Lung7臨床試驗(yàn)中[24]用于EGFR敏感突變陽性患者的中位PFS時(shí)間為11.0個(gè)月，OS時(shí)間為27.9個(gè)月，可較吉非替尼降低肺癌進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)和治療失敗風(fēng)險(xiǎn)。達(dá)克替尼是EGFR突變陽性的晚期NSCLC的替代治療方案。ARCHER 1050 研究[25]首次對(duì)比了達(dá)克替尼和吉非替尼療效的差異，結(jié)果顯示達(dá)克替尼治療組和吉非替尼治療組在PFS時(shí)間和OS時(shí)間均有差異，PFS時(shí)間在2組分別為14.7個(gè)月和9.2個(gè)月，OS時(shí)間在2組分別為34.1個(gè)月和26.8個(gè)月，表明達(dá)克替尼療效優(yōu)于吉非替尼，是EGFR敏感突變陽性的晚期NSCLC患者治療新選擇。奧西替尼(osimertinib，AZD9291)是第3代EGFR-TKI藥物，被推薦為EGFR突變患者全身治療前和全身治療中的首選藥物和疾病進(jìn)展治療藥物，其PFS時(shí)間較厄洛替尼或吉非替尼延長，PFS時(shí)間可達(dá)18.9個(gè)月。但是大多數(shù)亞洲國家還未批準(zhǔn)奧西替尼用于一線治療，僅作為TKI耐藥后的治療策略。

(3)指導(dǎo)組織EGFR稀有突變陽性的NSCLC患者的TKI靶向治療

除EGFR敏感突變外，EGFR稀有突變患者使用EGFR-TKI治療的研究尚在探索中。有研究[26]表明存在EGFR稀有突變的NSCLC患者(G719X,L861Q和S768I)較敏感突變患者對(duì)EGFR-TKI應(yīng)答率更低(32.4% vs 63.8%，P<0.001)，而經(jīng)一線含鉑類藥物(紫杉醇/卡鉑或順鉑)治療的效果更好，認(rèn)為對(duì)于EGFR稀有突變NSCLC患者應(yīng)接受以鉑類為基礎(chǔ)藥物的化療方案，EGFR-TKI僅作為二線或三線治療藥物保留。隨后，Shi等[27]的研究卻發(fā)現(xiàn)中國人群EGFR稀有突變患者(G719X，L861Q，S768I)使用一代EGFR-TKI藥物與含鉑類藥物化療的PFS時(shí)間無差異(7.1個(gè)月vs 6.1個(gè)月，P=0.893)，提出稀有突變NSCLC患者采用第1代EGFR-TKI藥物或含鉑類藥物化療作為一線治療方案可獲得幾乎相同的存活率。因此EGFR稀有突變NSCLC患者使用EGFR-TKI作為一線治療方案目前還存在爭議，需要更多的臨床證據(jù)和研究數(shù)據(jù)支持。目前，主要推薦使用第2代EGFR-TKI治療EGFR稀有突變的NSCLC患者，首選阿法替尼，用于G719X、E719X、L861Q、S768I等多種稀有突變NSCLC患者。但20號(hào)外顯子插入突變中除A763_A764insFQEA 突變外(如D770_N771insNPG)均對(duì)EGFR-TKI不敏感，韓國研制的Poziotinib或可成為這類患者治療有效的靶向藥物[28]。

(4)指導(dǎo)EGFR耐藥突變NSCLC患者的TKI靶向治療

第1代和第2代EGFR-TKI藥物在治療1～2年內(nèi)約有50%的NSCLC患者出現(xiàn)獲得性T790M耐藥[29]。第3代EGFR-TKI藥物則是針對(duì)獲得性T790M耐藥的靶向治療藥物，主要有奧西替尼、olmutinib(HM61713)等。奧西替尼是目前FDA唯一批準(zhǔn)的用于EGFR耐藥的治療藥物。AURAⅡ期研究[30]使用奧西替尼治療EGFRT790M突變陽性的經(jīng)治NSCLC患者的ORR為66%，中位PFS時(shí)間為11個(gè)月，治療效果較理想。第3代EGFR-TKI的臨床應(yīng)用尚在研究中，研究發(fā)現(xiàn)第3代EGFR-TKI治療后可出現(xiàn)獲得性C797S耐藥突變。第4代TKI藥物羅西替尼(rociletinib，EAI045)則針對(duì)C797S耐藥突變研發(fā)的藥物，它在小鼠模型試驗(yàn)中證實(shí)與西妥昔單抗聯(lián)合用藥對(duì)C797S和T790M耐藥突變有效，臨床試驗(yàn)中的有效性還有待驗(yàn)證[31]。

2.2評(píng)估NSCLC患者EGFR-TKI治療效果EGFR基因突變作為NSCLC治療的分子靶標(biāo)，可作為EGFR-TKI治療效果監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。經(jīng)EGFR-TKI治療后血漿EGFR突變檢測(cè)轉(zhuǎn)為陰性的NSCLC患者，PFS時(shí)間較EGFR突變狀態(tài)無變化患者和靶向治療后T790M突變的患者延長(P<0.5)[32]，且治療有效患者的血漿EGFR基因突變水平和影像學(xué)檢查結(jié)果相關(guān)性較好[33]。因此TKI藥物治療中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血漿EGFR突變狀態(tài)，與影像學(xué)檢查同樣適用于評(píng)估接受TKI藥物靶向治療患者治療效果。Ni等[34]的研究發(fā)現(xiàn)接受吉非替尼治療的轉(zhuǎn)移性肺癌患者治療后出現(xiàn)疾病進(jìn)展時(shí)，血漿EGFR敏感突變濃度升高，T790M突變濃度也協(xié)同升高，而腫瘤負(fù)荷(測(cè)量靶腫瘤病灶的直徑之和)不可測(cè)量或保持不變；對(duì)T790M突變陽性的患者進(jìn)行二線治療(局部放療+吉非替尼；吉非替尼+化療；化療)后，EGFR敏感突變濃度和T790M突變濃度降低，而二次進(jìn)展時(shí)又再次升高。這說明EGFR突變檢測(cè)對(duì)治療過程中患者的療效和疾病進(jìn)展有較好的評(píng)估價(jià)值，較腫瘤負(fù)荷能更好地監(jiān)測(cè)靶向治療患者疾病狀態(tài)。另一項(xiàng)研究[35]也有類似發(fā)現(xiàn)。EGFR突變陽性的NSCLC患者經(jīng)厄洛替尼治療后血漿EGFR敏感突變濃度降低，而治療后出現(xiàn)疾病進(jìn)展的患者血漿EGFR敏感突變濃度和T790M耐藥突變濃度均升高，且T790M突變最早可在臨床評(píng)估疾病進(jìn)展前344天被檢測(cè)到，說明血漿EGFR突變檢測(cè)對(duì)早期評(píng)估NSCLC患者EGFR-TKI治療效果和耐藥情況至關(guān)重要。綜上，EGFR突變狀態(tài)可反映NSCLC患者EGFR-TKI治療效果，檢測(cè)靶向治療前后EGFR突變變化水平是臨床評(píng)估治療效果和調(diào)整治療方案的有效措施。

2.3指導(dǎo)NSCLC患者外科術(shù)后的輔助治療 以順鉑為基礎(chǔ)的化療是Ⅱ～Ⅲ期NSCLC患者手術(shù)后的標(biāo)準(zhǔn)輔助治療方案。但是化療的有效性低，不良反應(yīng)多。為此，2018版《非小細(xì)胞肺癌術(shù)后輔助治療中國胸外科專家共識(shí)》中積極推薦Ⅲa期EGFR基因突變陽性的NSCLC患者完全切除術(shù)后使用EGFR-TKI作為輔助治療(ⅠB)。ADJUVANT研究[14]佐證了上述結(jié)論。組織EGFR敏感突變陽性的早期可手術(shù)NSCLC患者術(shù)后經(jīng)吉非替尼治療后的中位PFS時(shí)間較化療組(順鉑+長春瑞濱)延長(28.7個(gè)月vs 18.0個(gè)月，P=0.005 4)，安全性也優(yōu)于化療組。提示EGFR-TKI治療對(duì)經(jīng)檢測(cè)為EGFR突變陽性的NSCLC患者術(shù)后的輔助治療效果較傳統(tǒng)化療好。而對(duì)未經(jīng)EGFR基因突變篩選的NSCLC患者，RADIANT研究[36]隨機(jī)將納入的973例可手術(shù)早期NSCLC患者分為厄洛替尼治療組和安慰劑組，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)厄洛替尼組和安慰劑組中位PFS時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(50.5個(gè)月 vs 48.2個(gè)月，P=0.324)。單獨(dú)分析其中EGFR突變陽性的161例患者則發(fā)現(xiàn)2組中位PFS時(shí)間有差異(46.4個(gè)月 vs 28.5個(gè)月，P<0.01)。因此，外科手術(shù)的NSCLC患者也需進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)，突變陽性患者可從術(shù)后EGFR-TKI靶向輔助治療中獲益。

3 EGFR基因檢測(cè)應(yīng)注意的問題

3.1檢測(cè)樣本類型的選擇 組織作為NSCLC患者EGFR基因突變的主要檢測(cè)材料，在臨床應(yīng)用時(shí)存在諸多不足，如腫瘤異質(zhì)性、取材困難、患者依從性差、檢測(cè)周期長等，臨床實(shí)踐中EGFR的受檢率僅為20%～30%。而外周血因其無創(chuàng)傷性和實(shí)時(shí)檢測(cè)的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且與組織檢測(cè)結(jié)果的一致性可達(dá)80%以上[37]，是未來臨床應(yīng)用的重要發(fā)展方向。2015年 CFDA就提出在腫瘤組織不可評(píng)估的情況下，可獲取血液(血漿)標(biāo)本中DNA評(píng)估EGFR基因突變狀態(tài)，用于篩選可能從吉非替尼治療中獲益的NSCLC患者。2019年的NCCN指南也推薦在特定情況下，如患者身體條件不適合有創(chuàng)組織采樣，或初診患者病理確診后沒有充足的檢測(cè)材料用于分子檢測(cè)，或所有組織未發(fā)現(xiàn)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的患者隨訪時(shí)，可考慮檢測(cè)血漿cfDNA/ctDNA。當(dāng)出現(xiàn)因T790M耐藥導(dǎo)致疾病進(jìn)展時(shí)，須優(yōu)先考慮檢測(cè)血漿T790M突變。若血漿檢測(cè)陰性，強(qiáng)烈推薦再次活檢取材檢測(cè)T790M突變。

此外，其他體液如尿液、胸腔積液、腦脊液中的游離DNA成分也可用于EGFR突變的檢測(cè)。

尿液cfDNA是循環(huán)中游離的片段DNA通過腎臟的濾過屏障濃縮到尿液中形成。尿液cfDNA和組織EGFR檢測(cè)的總一致率為88%[38]。Li等[39]報(bào)道在早期(Ⅰ/Ⅱ期)NSCLC患者尿液cfDNA中，19del和L858R的檢出率分別為30%和56%，與組織總一致率為42%；而在晚期(Ⅲ/Ⅳ期)NSCLC患者尿液中，19del和L858R的檢出率分別為89%和97%，與組織總一致率為93%。因此尿液cfDNA檢測(cè)用于晚期腫瘤EGFR突變狀態(tài)檢測(cè)優(yōu)于早期腫瘤患者。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明[40]，當(dāng)尿液輔助組織用于EGFR檢測(cè)時(shí)，T790M檢出率可增加7%，采取相應(yīng)的TKI靶向治療后可使PFS時(shí)間和OS時(shí)間分別增加0.44和0.35個(gè)月，減輕56%的患者約1 243～1 680美元的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)無創(chuàng)的治療實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)手段，在未來值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

15%初治和10%～50%治療中的NSCLCL患者出現(xiàn)胸腔積液，也可作為EGFR基因檢測(cè)的檢測(cè)材料，用于腫瘤靶向治療療效和預(yù)后評(píng)估。胸腔積液中存在EGFR19del或L858R突變的NSCLC患者，靶向治療應(yīng)答率達(dá)94.1%，PFS時(shí)間較未檢測(cè)到EGFR突變或存在T790M突變的患者更長(10.8個(gè)月vs 4.2個(gè)月vs 1.7個(gè)月)[41]。胸腔積液分為上清液和沉渣，二者均可檢測(cè)到EGFR基因，但哪一種更適合EGFR的檢測(cè)尚不明確。Lin等[42]報(bào)道稱以組織檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，配對(duì)胸腔積液上清液和沉渣聯(lián)合檢測(cè)EGFR基因突變的敏感性、特異性和一致率分別為92.3%、100%和95.5%。而上清液和沉渣中EGFR檢測(cè)結(jié)果不一致率為18.2%，上清液的敏感性高于沉渣(92.3% vs 69.2%)。但是Liu等[43]通過采用ARMS方法檢測(cè)80例ⅢB/Ⅳ期的肺腺癌患者組織、胸腔積液上清液及沉渣中EGFR突變，發(fā)現(xiàn)沉渣較上清液用于EGFR的檢測(cè)敏感性更高(81.8% vs 63.6%)。因此目前的研究還存在爭議，難以明確哪種成分用于EGFR檢測(cè)更為準(zhǔn)確。

第1代或第2代EGFR-TKI治療的EGFR突變的NSCLC患者，約30%的患者會(huì)發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。Zhao等[44]對(duì)比了7例腦轉(zhuǎn)移性NSCLC患者腦脊液和血漿EGFR突變狀態(tài)，采用AMRS和ddPCR方法檢測(cè)的7例患者腦脊液EGFR突變均為陽性，包括4例19del突變，3例L858R突變，其中1例存在19del和T790M兩種突變。但是配對(duì)血漿中2種方法5例檢測(cè)為陰性(71.4%)，ddPCR方法檢測(cè)另2例為19del和T790M突變陽性，而AMRS方法檢測(cè)1例為19del和T790M突變陽性，1例僅有19del突變陽性。因此腦轉(zhuǎn)移NSCLC患者進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)時(shí)，選擇腦脊液作為檢測(cè)樣本優(yōu)于血漿，值得未來深入研究并推向臨床。

3.2血液樣本采集及處理 2017年歐美學(xué)者發(fā)布的《晚期非小細(xì)胞肺癌患者ctDNAEGFR基因突變檢測(cè)指南》 和吳一龍教授等牽頭修訂的2018版《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR突變檢測(cè)中國專家共識(shí)》等均對(duì)外周血EGFR基因檢測(cè)的標(biāo)本采集提出了具體的要求。雙方指南均指出EGFR基因突變時(shí)血漿優(yōu)于血清。外周血采集需使用cfDNA專用的常溫采血管或常規(guī)EDTA抗凝管，采集10 mL靜脈血。為防止全血中白細(xì)胞破裂釋放大量的野生型DNA造成背景干擾，常規(guī)EDTA-K2抗凝管采血后需立即分離血漿，最多可延長至2 h內(nèi)；專用cfDNA采集管內(nèi)含有游離DNA保護(hù)劑和細(xì)胞膜固定劑，因此可常溫放置1周左右。全血在進(jìn)行血漿分離時(shí)，建議低速離心后再進(jìn)行高速離心以使細(xì)胞及其碎片被充分清除。分離后的血漿可放置于-20 ℃短期儲(chǔ)存；長期儲(chǔ)存需放置于-80 ℃內(nèi)，并避免反復(fù)凍融。目前市面上血漿cfDNA提取試劑盒較多，但是不同試劑盒的提取方法和提取效率上存在差異。Solassol等[45]比較了5種用于cfDNA提取的商業(yè)試劑盒的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的方法均可用于cfDNA的提取，其中Norgen試劑盒提取到的cfDNA濃度最高，Zymo Research試劑盒可提取到180 bp和400 bp的DNA片段。在考慮到Zymo Research試劑盒可減少PCR抑制劑的影響的情況下，該研究認(rèn)為其是最佳的選擇。

3.3非組織樣本檢測(cè)方法 血液等非組織樣本對(duì)NSCLC患者的治療指導(dǎo)和療效監(jiān)測(cè)均有重要價(jià)值。但是與腫瘤組織相比，大多檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)血漿EGFR基因檢測(cè)的敏感性僅為50%～70%，且在不同分期腫瘤患者中的敏感性還存在差異。不僅如此，用于EGFR基因檢測(cè)的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumur DNA，ctDNA)占游離DNA的比例不到1%，因此對(duì)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度要求較高。目前國內(nèi)外指南或共識(shí)均無關(guān)于非組織樣本EGFR檢測(cè)平臺(tái)的推薦。

基于AMRS技術(shù)開發(fā)的CobasEGFRMutation Test v2(美國羅氏公司)是FDA首個(gè)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的外周血EGFR基因檢測(cè)試劑盒，用于NSCLC患者厄洛替尼治療的伴隨診斷，分析靈敏度為1%。該試劑盒檢測(cè)NSCLC患者19del、L858R和T790M的敏感性分別為86%、90%和40%，特異性均為100%[46]。經(jīng)改進(jìn)的super-AMRS的分析靈敏度可達(dá)0.2%，2018年已獲CFDA認(rèn)證用于血漿EGFR的檢測(cè)。

數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)技術(shù)分析的靈敏度可達(dá)0.1%，可實(shí)現(xiàn)微量EGFR基因突變的絕對(duì)定量。dPCR方法檢測(cè)NSCLC患者血漿ctDNA中19del、L858R突變和T790M的敏感性分別為82%、74%和77%，特異性分別為100%、100%和79%，證實(shí)了dPCR技術(shù)檢測(cè)血漿中EGFR突變的敏感性和特異性較好[47]。但是dPCR在臨床應(yīng)用中還存在一些亟需解決的問題。dPCR技術(shù)檢測(cè)EGFR突變時(shí)大多數(shù)一次僅能檢測(cè)1種已知突變，當(dāng)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)時(shí)需進(jìn)行多次dPCR檢測(cè)。Yu等[48]采用新開發(fā)的多重dPCR方法可使19del檢測(cè)的敏感性和特異性分別達(dá)到90.9%和88.9%，L858R檢測(cè)的敏感性和特異性分別為87.5%和100%，T790M檢測(cè)的敏感性和特異性分別為100%和93.8%，說明這種新開發(fā)的多重dPCR方法可實(shí)現(xiàn)EGFR基因突變多點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)。另一個(gè)問題是dPCR臨床應(yīng)用的性能驗(yàn)證還缺乏標(biāo)準(zhǔn)化指南，不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的一致性較差，檢測(cè)結(jié)果的可靠性存在爭議。有學(xué)者建議借鑒臨床化學(xué)性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)指南的經(jīng)驗(yàn)，或可解決實(shí)驗(yàn)室性能評(píng)估和質(zhì)量控制的問題[49]。

下一代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)采用邊合成邊測(cè)序的原理，在芯片中進(jìn)行大規(guī)模的平行深度測(cè)序，實(shí)現(xiàn)一次性對(duì)大量基因序列進(jìn)行分析，其分析靈敏度為0.02%～5%。添加分子唯一識(shí)別碼(UMI)的Oncomine Lung cfDNA (OLcfDNA)二代測(cè)序檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血漿T790M的敏感性為95.8%，特異性為100%，準(zhǔn)確性為96.9%，最低檢測(cè)限為1%[50]，具有較好的檢測(cè)效能。但是NGS用于檢測(cè)ⅠA～ⅢA期NSCLC患者血漿EGFR突變的總敏感性遠(yuǎn)低于ⅢB～Ⅳ期患者(22.2% vs 72.7%)。因此更推薦采用NGS方法檢測(cè)晚期NSCLC患者EGFR突變狀態(tài)。

3.4檢測(cè)結(jié)果報(bào)告EGFR基因突變檢測(cè)采用不同的檢測(cè)方法所需要的報(bào)告時(shí)間不同，中國專家建議在滿足臨床需求的前提下，所有EGFR基因突變分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)平臺(tái)建設(shè)和流程優(yōu)化后的報(bào)告周期不超過3～5個(gè)工作日。EGFR基因突變檢測(cè)報(bào)告單應(yīng)包括6部分的內(nèi)容：(1)患者基本信息；(2)檢測(cè)標(biāo)本信息；(3)檢測(cè)項(xiàng)目名稱、方法及檢測(cè)結(jié)果；(4)檢測(cè)結(jié)果的解釋及參考文獻(xiàn)；(5)檢測(cè)說明及備注；(6)報(bào)告發(fā)出單位及時(shí)間。患者基本信息包括姓名、年齡、性別、科別、住院號(hào)、床號(hào)、臨床診斷等。檢測(cè)標(biāo)本信息包括標(biāo)本類型、標(biāo)本狀態(tài)、采樣時(shí)間、送檢時(shí)間、接收時(shí)間、送檢醫(yī)生及聯(lián)系方式。檢測(cè)項(xiàng)目名稱應(yīng)具體到EGFR基因突變位點(diǎn)全稱及縮寫。報(bào)告中應(yīng)注明核酸提取的方法及DNA質(zhì)量，EGFR基因突變檢測(cè)的方法、儀器及試劑名稱。檢測(cè)結(jié)果中的異常結(jié)果應(yīng)顯著標(biāo)識(shí)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果的解釋包括檢測(cè)項(xiàng)目的臨床意義，當(dāng)次檢測(cè)結(jié)果中存在的異常結(jié)果解釋及可能的解決方案，檢測(cè)方法的檢測(cè)性能和局限性，陰陽性對(duì)照和質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果，解釋中涉及的參考文獻(xiàn)等。檢測(cè)說明中需提到當(dāng)次檢測(cè)涉及的范圍，不同檢測(cè)結(jié)果報(bào)告方式的說明，標(biāo)本的狀態(tài)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響及其他可能的影響因素。最后，報(bào)告單中還應(yīng)明確當(dāng)次檢測(cè)人員姓名、審核者姓名、報(bào)告時(shí)間、報(bào)告單位的名稱、地址及聯(lián)系方式等。檢測(cè)報(bào)告單的內(nèi)容應(yīng)全面具體、通俗易懂，以供臨床醫(yī)師參考。

4 總結(jié)及展望

基于EGFR基因突變檢測(cè)已成為NSCLC臨床治療與療效評(píng)估的關(guān)鍵措施，展現(xiàn)出極具潛力的發(fā)展前景。對(duì)于臨床初治的NSCLC患者和可手術(shù)的早期NSCLC患者，檢測(cè)組織和血液中的EGFR基因突變?yōu)殛栃缘幕颊呔墒褂肊GFR-TKI藥物，可有效延長患者PFS時(shí)間和OS時(shí)間。但TKI藥物使用后患者可能出現(xiàn)耐藥或者進(jìn)展，而影像學(xué)評(píng)估大多需要3個(gè)月，因此治療過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)EGFR基因的突變狀態(tài)對(duì)早期評(píng)估TKI療效和預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展至關(guān)重要。血液在臨床應(yīng)用時(shí)簡單易得，是實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)EGFR基因突變狀態(tài)的理想材料。但是血液樣本EGFR基因突變檢測(cè)與組織檢測(cè)結(jié)果的一致性仍是目前面臨的重要問題。而且血液中僅含有極少量的腫瘤DNA，目前的技術(shù)分析靈敏度最高到0.1%，還需開發(fā)更高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)。不僅如此，臨床對(duì)血液EGFR突變標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)流程的制定和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。因此，未來圍繞EGFR基因在治療指導(dǎo)和療效監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用、血液新檢測(cè)技術(shù)開發(fā)和檢測(cè)規(guī)范等方面還需要投入更多的研究，以期擴(kuò)大TKI靶向治療受益人群，改善患者預(yù)后。