郭躍麗，孔萬仲，萬菁，蔡文品，陳孟權，奚經巧(溫州市中醫(yī)院檢驗科，浙江溫州325000)

遺傳性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷癥是一種罕見的常染色體遺傳性出血性疾病，常見于近親婚配的家族。大部分患者主要表現(xiàn)為黏膜出血，例如鼻出血、牙齦出血、瘀斑等，女性患者可表現(xiàn)為月經量增多[1-2]。其臨床表現(xiàn)具有高度異質性，出血嚴重程度與基因突變位點、突變數量、突變類型等密切相關[3]。因此，分析F7基因突變對遺傳性FⅦ缺陷癥具有重要意義。本研究對1例近親婚配的遺傳性FⅦ缺陷癥患者進行凝血指標檢測與基因分析，初步探討其分子發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1家系資料 先證者，男，48歲，漢族，浙江樂清人，因“無故反復性鼻出血”1 d于2018年3月16日就診于我院五官科。凝血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)，血漿凝血酶原時間(PT)延長(為31.2 s)，F(xiàn)Ⅶ活性(FⅦ:C)、FⅦ抗原(FⅦ:Ag)均降低(分別為4%和6%)，其他凝血指標均無異常，肝、腎功能正常，平素無明顯自發(fā)出血癥狀。其父母為姑表近親婚配，家系其他成員均無自發(fā)出血癥狀。該先證者的家系圖見圖1。

圖1 1例遺傳性FⅦ缺陷癥先證者的家系圖

1.2健康人對照 收集150例體檢健康者，其中男性86例，女性64例，年齡21～48歲，無肝、腎功能異常，無出血及血栓史，無抗凝劑用藥史，女性未口服避孕藥。建立本次實驗室凝血表型指標的參考區(qū)間。所有研究對象均知情同意。

1.3標本采集與處理 采集研究對象空腹靜脈血標本2.7 mL，用0.109 mol/L枸櫞酸鈉溶液抗凝。標本3 000 r/min離心15 min后，取上層乏血小板血漿用于各凝血指標的檢測，2 h內完成；下層血細胞于-40 ℃凍存，待用于基因組DNA的抽提。

1.4凝血指標檢測 PT、凝血活酶時間(APTT)的檢測采用一期凝固法；纖維蛋白原(Fib)的檢測采用Clause法；FⅦ:C、凝血因子Ⅹ活性(FⅩ:C)、凝血因子Ⅴ活性(FⅤ:C)和凝血因子Ⅱ活性(FⅡ:C)均采用基于PT的一期凝固法檢測。以上均采用Stago STA-R全自動血凝儀及其原裝配套試劑(法國STAGO公司)嚴格按照試劑說明書完成檢測。

1.5外周血基因組DNA提取 選用酚-氯仿法提取先證者及其家系成員的外周血細胞基因組DNA，并用DU800核酸蛋白分析儀檢測所提取基因組DNA的濃度和純度。所有步驟均按照酚-氯仿法基因組DNA提取試劑盒說明書進行，基因組DNA提取試劑盒由北京天根生物公司提供。

1.6引物及PCR擴增 根據F7基因序列(GenBank J02933)，用Primer Premier 5.0軟件分別設計11對引物以覆蓋F7基因的所有外顯子、5′和3′非翻譯區(qū)序列、側翼，引物序列及PCR擴增條件參見文獻[3]。引物由上海桑尼生物公司合成。

1.7PCR產物測序 PCR產物割膠后送上海桑尼生物工程公司純化后用ABI3730XL型測序儀(美國Applera公司)測序。通過Chromas軟件與美國NCBI 基因庫所公布的F7基因序列(GenBank GI180333和J02933序列)以及F7突變數據庫(http://europium.csc.mrc.ac.uk)在Blaster軟件上(http:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行比對，查找基因突變的位點，發(fā)現(xiàn)突變位點后，再利用反向測序予以證實。明確先證者基因突變的位點后，利用PCR擴增其他家系成員的相應突變位點區(qū)域并進行測序分析。

1.8生物信息學技術分析 采用ClustalW軟件分析氨基酸突變位點保守性，采用PolyPhen-2、SIFT軟件分析氨基酸突變前后生物信息學特性，采用Swiss-pdb Viewer軟件分析FⅦ蛋白模型野生型和突變型局部空間構型及分子間作用力的變化。

2 結果

2.1先證者及其家系成員凝血指標水平 先證者PT明顯延長；FⅦ：C和FⅦ：Ag較健康人對照降低。先證者母親、父親、大姐、二姐和哥哥PT均稍延長；FⅦ：C和FⅦ：Ag均下降至健康人對照的一半左右，家系成員的其他凝血指標均無異常(表1)。

表1 先證者及其家系成員主要凝血指標檢測結果

2.2先證者及其家系成員基因分析 先證者F7基因(GenBank GI180333)第8外顯子存在c.1224 T>G純合錯義突變導致p.His348Gln，其母親、父親、大姐、二姐和哥哥均存在c.1224 T>G雜合錯義突變，其外甥女為野生型(圖2)。

注：A，先證者c.1224T>G純合子突變;B，母親c.1224T>G雜合子突變；C，正常序列；箭頭示突變位置。

圖2遺傳性FⅦ缺陷癥家系第8號外顯子測序結果

2.3生物信息學技術分析 用ClustalⅩ-2.1-win軟件對人類和 NCBI 數據庫中提供的其他9種同源性物種F7基因氨基酸序列進行多重比對。圖3中箭頭所指為FⅦ的348位氨基酸His，目標線全部為H，表明該氨基酸在同源物種中具有高度保守的特性。

圖3 不同物種間FⅦ的His348的氨基酸序列比對

分別用PolyPhen-2和SIFT在線生物信息學軟件對FⅦ突變后蛋白質通過評分預測功能：His348Gln的PolyPhen-2預測結果為1.000，提示“可能是有害的”；SIFT預測結果為0.32，提示“影響蛋白質功能”。用Swiss-Pdb Viewer version軟件對FⅦ His348Gln突變前后的蛋白質結構進行模型分析：野生型蛋白質的分子模型結構中His348與Thr359和Gly360之間存在5條氫鏈，當親水性的Gln348取代堿性的His348時芳香環(huán)消失，Gln348與Thr359之間少了1條氫鏈。見圖4。

注：A，野生型；B，His348Gln突變型；綠色虛線表示氫鍵。

3 討論

遺傳性FⅦ缺陷癥是一種常染色體隱性遺傳性出血性疾病，其臨床表現(xiàn)與血漿FⅦ：C無明顯相關性，重癥患者多為影響基因結構和功能的純合或者復合雜合突變所致，其FⅦ：C通常低于2%；而單一雜合突變患者的FⅦ：C一般不低于30%，幾乎無臨床癥狀[4]。大約有1/3的FⅦ缺陷癥患者可終身無出血表現(xiàn)，這些患者往往是在家族史研究或者止血試驗篩查時被發(fā)現(xiàn)[5]。本研究家系中的先證者凝血常規(guī)篩查發(fā)現(xiàn)PT延長、FⅦ：C和FⅦ：Ag減低，診斷為FⅦ缺陷癥。通過先證者和家系成員的基因分析發(fā)現(xiàn)：先證者存在F7基因c.1224T>G純合子錯義突變，分別遺傳自攜帶c.1224 T>G雜合錯義突變的父親和母親。先證者F7基因第8號外顯子存在純合錯義突變c.11482 T>G，導致p.His348Gln。家系中母親、父親、大姐、二姐和哥哥均存在c.1224 T>G雜合錯義突變，其FⅦ：C和FⅦ：Ag均約下降至健康人對照的一半，與國內外相關報道[6-7]一致。

國際上關于F7基因His348Gln突變位點的第1個病例由日本Katsumi教授報道[8]，在對該突變位點進行體外表達研究發(fā)現(xiàn)，該突變可改變FⅦ的空間結構，導致其分泌障礙，致使血漿中的FⅦ:C及FⅦ：Ag均降低，表現(xiàn)為交叉反應物質陰性(CRM-)，表明His348Gln純合突變會影響FⅦ的分泌功能。Ding等[9]研究了其致病機制，亦證實His408(348)Gln 雙雜合突變影響FⅦ的合成。本研究家系發(fā)現(xiàn)的His348Gln突變位點用Swiss-Pdb Viewer version 軟件對突變前后的蛋白質結構進行模型分析，結果顯示：野生型蛋白質的分子模型結構中His348與Thr359和Gly360之間存在5條氫鏈，當親水性的Gln348取代堿性的His348時芳香環(huán)消失，Gln348與Thr359之間缺失了1條氫鏈。FⅦa與組織因子(TF)結合的活化位點在Met306[10]，將該位點的Met進行氨基酸替換后，可打破原有的正常氫鏈結構，從而阻斷TF對FⅦ的活化過程。本研究報道的His348位于Met306附近，蛋白質結構分析顯示突變后可導致原有氫鏈數量的減少。因此我們推測該突變可能也會影響TF對FⅦ的活化過程，是否由于TF-FⅦa復合物在不同情況下存在不同的生理活性，從而使F7基因即使具有相同的突變位點，但若還有其他影響TF-FⅦa復合物形成的因素存在的情況下，仍可導致不同的臨床表現(xiàn)。