梁純子，朱滿，伍仕敏，涂建成(1.武漢大學(xué)檢驗(yàn)系，武漢 40071；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科&基因診斷中心，武漢 40071；.長江航運(yùn)總醫(yī)院&武漢腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢400)

脂質(zhì)異常與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，AsCVD)密切相關(guān)，低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)水平升高是心血管事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；而通過他汀類藥物降低LDL-C水平減少心血管事件的發(fā)生率是目前防治指南的基礎(chǔ)[1-2]。近期更有研究證實(shí)低密度脂蛋白顆粒(low-density lipoprotein-particle，LDL-P)直接參與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)的病理進(jìn)展，是冠心病(coronary artery disease，CAD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。因此，作為AsCVD預(yù)防、評(píng)估、診斷和干預(yù)極為重要的靶值，LDL-C和LDL-P結(jié)果的真實(shí)性倍受關(guān)注。高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是中國最常見的血脂異常，通常伴隨多種代謝異常，如肥胖、代謝綜合征、2型糖尿病和某些遺傳型脂質(zhì)紊亂等[4]。由于此類患者普遍存在不尋常的脂蛋白分布，采用臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的血脂生化方法如均相法和Friedwald公式間接法檢測LDL-C/LDL-P有較大的局限性，得到的數(shù)據(jù)與臨床實(shí)際相符度不高，影響后續(xù)診療效果，需要予以改良。垂直梯度離心法血脂檢測技術(shù)(vertical auto profile lipid panel plus，VAP+)原理獨(dú)立于公式法，血漿中高三酰甘油(triglycerides，TG)水平對(duì)其影響較小，在HTG患者血脂檢測科學(xué)性和準(zhǔn)確性中具有一定的優(yōu)勢。因此，本文將綜述該方法的技術(shù)原理和特點(diǎn)，并評(píng)價(jià)該方法在HTG患者血脂檢測中的應(yīng)用。

1 VAP+血脂檢測技術(shù)原理

VAP+是一種用于定量測定血漿脂蛋白亞組分、脂蛋白膽固醇含量及脂蛋白顆粒濃度的自動(dòng)化檢測體系[5]。 VAP+方法學(xué)上參考經(jīng)典的超速離心法，在特殊的梯度介質(zhì)溶液中，垂直超速離心將血漿脂蛋白按密度大小進(jìn)行連續(xù)穩(wěn)定的分層；分別為極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)、 LDL各亞型、中間密度脂蛋白(intermediate-density lipoprotein，IDL)、脂蛋白殘粒(remnant-like lipoprotein particle，RLP)、脂蛋白(a)[lipoprotein (a)，Lp(a)]和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)；分離后的脂蛋白依次連續(xù)通過離心管底部，按分層順序流出并與相應(yīng)的膽固醇檢測試劑混合反應(yīng)，隨后探頭記錄連續(xù)反應(yīng)的光譜變化；根據(jù)出峰時(shí)間和面積，專用分析軟件基于大量積累的人群數(shù)據(jù)，區(qū)分每一類型的脂蛋白，最終計(jì)算該類脂蛋白顆粒對(duì)應(yīng)的膽固醇含量。

VAP+可以直接檢測出的脂蛋白亞組分膽固醇包括HDL、LP(a)、LDL、IDL 和VLDL及亞型(HDL2～3、LDL1～4、VLDL1～3)(圖1)。同時(shí)，血漿樣品中LDL-P可通過特殊的緩沖分離液提取出來，利用激光散色原理獲取顆粒平均體積大小，計(jì)算出LDL-P型別和濃度：A型LDL-P，大而輕LDL顆粒為主；B型LDL-P，小而密LDL顆粒(small and dense-LDL, sd-LDL)為主；AB中間型LDL-P[5-6]。

圖1 VAP+血脂檢測技術(shù)原理和流程示意圖

2 HTG患者中Friedwald公式法LDL-C檢測的局限性

LDL主要負(fù)責(zé)將膽固醇由肝臟運(yùn)送到全身組織，LDL-C水平在缺血性心臟病發(fā)生相對(duì)危險(xiǎn)和絕對(duì)危險(xiǎn)中的上升趨勢及程度與總膽固醇水平一致。目前，包括美國國家膽固醇教育計(jì)劃(national cholesterol education program，NCEP)在內(nèi)，國內(nèi)外多個(gè)AsCVD的防治指南均以LDL-C作為實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)項(xiàng)目進(jìn)行疾病的風(fēng)險(xiǎn)控制，認(rèn)為LDL-C是評(píng)價(jià)As進(jìn)展最重要的無創(chuàng)傷性指標(biāo)。例如《中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)》直接以LDL-C水平為主要指標(biāo)區(qū)分 AsCVD高危人群[7-8]。但實(shí)驗(yàn)室中LDL-C檢測值的真實(shí)性受到多種因素的影響，水平低估常導(dǎo)致AsCVD漏診、風(fēng)險(xiǎn)性誤判和用藥失誤。在Framingham心血管病研究中，80% CAD患者的血脂處于正常范圍，按目前的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)應(yīng)劃分到“低危人群”[9]，與患者心血管病變程度明顯不相符。

臨床實(shí)驗(yàn)室常用的LDL-C檢測方法有兩大類：基于Friedwald公式的間接計(jì)算法和基于特異性試劑封閉的勻相法?？紤]到各廠家封閉試劑成分不同，變異度較大，本文不做延伸，僅對(duì)比討論Friedwald公式間接法與VAP+檢測LDL-C的優(yōu)劣[10]。

Friedwald公式是指在空腹情況下，即外周血中沒有乳糜微粒(chylomicrons, CM)時(shí)：[TC]=[LDL-C]+[HDL-C]+[VLDL-C]，因此，[LDL-C]=[TC]-[HDL-C]-[VLDL-C]，另外，[VLDL-C]=[TG]/5，最終公式：[LDL-C]=[TC]-[HDL-C]-[TG]/5。如公式所示，LDL-C水平與標(biāo)本中的TG、CM及VLDL濃度直接相關(guān)。在健康人群正確空腹(>12 h)的情況下，實(shí)驗(yàn)室基于Friedwald公式，利用酶和底物迅速在血漿中測得LDL-C能夠反映其真實(shí)水平；但在糖尿病、心臟病、As和代謝綜合征等影響下的HTG患者中，此方法計(jì)算得出的LDL-C水平低于真實(shí)值[11]。

因此，早在2002年NCEP就提出新的LDL-C直接檢測方法學(xué)的要求，尤其患者存在HTG的情況下(TG>200 mg/dL)。而根據(jù)目前的檢測現(xiàn)狀，NCEP ATP Ⅲ指南建議當(dāng)TG>200 mg/dL時(shí)，非HDL-C應(yīng)該取代LDL-C作為新的二級(jí)治療干預(yù)的指標(biāo)[12]； 當(dāng)TG水平高于250 mg/dL時(shí)，患者外周血標(biāo)本的脂質(zhì)檢測項(xiàng)目包括LDL-C在內(nèi)需要通過其他方法學(xué)進(jìn)一步做更詳細(xì)的分析[13]。臨床普遍將高危人群降LDL-C的目標(biāo)值為低于100 mg/dL，而Friedwald公式并不適用于這一類患者LDL-C的檢測(有關(guān)研究認(rèn)為會(huì)造成近18.5%的誤差)[11,14-15]；近期研究建議將AsCVD高?；颊週DL-C水平控制在70 mg/dL以下，這一水平更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了公式法的適用范圍。因此，單純以公式法為基礎(chǔ)的LDL-C實(shí)驗(yàn)室檢測存在極大隱憂。

在2012年一項(xiàng)涉及130萬人的調(diào)查研究[16]中，以VAP+為檢測參照，F(xiàn)riedwald公式法得出的LDL-C水平和AsCVD風(fēng)險(xiǎn)值存在偏差。即當(dāng)TG水平高于參考區(qū)間(150～400 mg/dL)時(shí)，約25%～60%患者的LDL-C低于真實(shí)值，風(fēng)險(xiǎn)被低估；與此同時(shí)，在TG水平正常時(shí)，仍有12%～20%的患者應(yīng)劃分到更高的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)。這些偏差會(huì)對(duì)TG代謝紊亂患者的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)和干預(yù)效果產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響[17]。

LDL-C水平檢測不準(zhǔn)確還會(huì)影響到藥物與臨床結(jié)果之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。大量的綜述和meta分析顯示，F(xiàn)riedwald公式法獲得的LDL-C會(huì)造成部分臨床試驗(yàn)研究對(duì)象的選擇性偏差[12]。多個(gè)他汀類降脂藥物的研究(包括WOSCOP,CARE, HPS, A to Z, ASCOT-LLA, LIPID和 4S等)完全排除TG水平高于200～250 mg/dL的患者，部分原因是此類患者往往需要另外再單獨(dú)檢測LDL-C水平從而增加試驗(yàn)成本。因此，臨床上很大部分血脂異常(LDL-C、TG均高)的患者被排除在降脂藥物的三期臨床試驗(yàn)之外，由此得出的試驗(yàn)結(jié)論和臨床應(yīng)用可信度也隨之降低。

VAP+血脂檢測的核心原理是超速離心，特點(diǎn)是脂蛋白顆粒的原始狀態(tài)保存，從而直接檢測脂蛋白中的膽固醇而無需公式法的換算。實(shí)際上，這也是血脂檢測研究最經(jīng)典的方法，但之前往往需要24 h的長時(shí)間離心，無法滿足臨床快速檢測的要求。VAP+通過特殊的緩沖液和離心體系有效減少了離心時(shí)間(從24 h減少到1 h)；在檢測內(nèi)容上參照NCEP ATP Ⅲ指南，明確LDL-C和非HDL-C的目標(biāo)值；因此，VAP+檢測的LDL-C相對(duì)而言較為真實(shí)地反映出患者外周血中的脂質(zhì)狀態(tài)，且不受飲食限制和HTG的影響。在美國等多個(gè)地區(qū)推薦其用于胰島素抵抗、代謝綜合征、糖尿病等復(fù)雜性血脂異?；颊叩臋z測，從而正確評(píng)估其心血管相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)或降脂藥物的合理選擇[18]。

3 LDL-P的檢測

血漿中的TG主要存在于 CM、VLDL及其殘粒(remnants)中。當(dāng)外源性食物攝取(CM)和肝臟合成(VLDL)增多導(dǎo)致血漿TG上升時(shí)，膽固醇酯酶活性增加會(huì)促進(jìn)VLDL中的TG轉(zhuǎn)移至HDL和LDL中，顆粒中膽固醇比例減少。在肝脂酶和LPL的作用下HDL和LDL中的TG進(jìn)一步水解，最終形成體積小密度高(small and dense，sd-)的HDL和LDL顆粒。小而密的HDL顆粒易從腎臟排除，造成保護(hù)性HDL-C水平下降；但小而密的LDL顆粒(small and dense LDL-P，sd-LDL-P)在血管中停留半衰期明顯延長，濃度升高。滯留的LDL-P更易穿過血管壁內(nèi)皮被氧化，促進(jìn)As進(jìn)展[19-20]。臨床證據(jù)顯示40%～50%的確診CVD患者血漿sd-LDL-P濃度明顯升高[21]；與健康人群相比，sd-LDL升高的人群患CAD和心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)分別增加4和6.9倍，而高總膽固醇血癥和高LDL-C也僅僅增加該人群2倍的風(fēng)險(xiǎn)；且多個(gè)前瞻性研究和藥物臨床試驗(yàn)也證實(shí)降低sd-LDL-P能有效緩解As的進(jìn)展[22]。

HTG導(dǎo)致高sd-LDL-P，部分解釋了雖然中國高LDL-C的人群少，但CAD的發(fā)病率與西方國家相持不下的原因。2010年中國流行病學(xué)調(diào)查顯示，在97 209例18歲以上居民中高LDL-C血癥的患病率僅為2.1%，而HTG的患病率為11.3%；近半數(shù)心臟病急性發(fā)作的患者血漿LDL-C水平仍在正常范圍；在早發(fā)缺血性心血管病的患者中，只有25%出現(xiàn)LDL-C升高，58%的患者LDL-C水平仍低于參考區(qū)間下限(130 mg/dL)[23]。DYSIS中國研究報(bào)告覆蓋6個(gè)大區(qū)、122家醫(yī)院、17個(gè)省，結(jié)論是25 317例服用他汀3個(gè)月以上患者，仍有高達(dá)47.6%的患者伴隨HTG[24]。

sd-LDL-P被部分專家稱為血管中的“霧霾”，生動(dòng)說明體積小但致密的sd-LDL比大而輕的LDL更有危害性，是目前CVD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)最佳的預(yù)測因子。斯坦福的心臟風(fēng)險(xiǎn)干預(yù)計(jì)劃報(bào)告在LDL-C水平正常的人群中LDL-P密度更適合預(yù)測斑塊發(fā)展，是CAD和腦卒中的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因素[25]；波士頓大學(xué)開展的回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在3 066名受試者中LDL-P水平評(píng)測CVD風(fēng)險(xiǎn)甚至優(yōu)于LDL-C和非HDL-C[2,26]。因此，ATP-Ⅲ明確指出二級(jí)預(yù)防應(yīng)把LDL-P<1 000 nmol/L認(rèn)定為控制目標(biāo)值[26]。

HTG患者常伴有胰島素抵抗、代謝綜合征和糖尿病等基礎(chǔ)代謝異常。sd-LDL-P水平在此類患者的臨床評(píng)價(jià)中有重要意義：例如胰島素抵抗動(dòng)脈粥樣硬化研究(insulin resistance atherosclerosis study，IRAS)發(fā)現(xiàn)代謝綜合征和2型糖尿病患者，LDL-P濃度，而非LDL-C水平，與胰島素抵抗的嚴(yán)重程度正相關(guān)；Framingham心臟研究也得出類似結(jié)論，即糖耐受程度與LDL-P水平緊密相關(guān)，而與LDL-C則不相關(guān)。胰島素增敏藥物吡格列酮和n-3脂肪酸[魚油中提取的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳已烯酸(DHA)]可有效降低2型糖尿病患者血漿中LDL-P濃度，從而降低心肌梗死后患者心血管疾病死亡率(總體死亡率降低20%、心血管死亡事件減少30%、猝死的發(fā)生率降低45%)[27]；貝特類降脂藥物則通過激活過氧化物酶增生體活化受體a(PPARa)，調(diào)節(jié)LPL、載脂蛋白AⅠ和AⅡ的表達(dá)，使sd-LDL-P轉(zhuǎn)變?yōu)榇蠖杷傻腖DL，改善血脂紊亂狀態(tài)[28]。值得注意的是，此項(xiàng)研究的血脂檢測數(shù)據(jù)均通過VAP+檢測方法獲得。

目前測定sd-LDL-P的主要方法包括：梯度凝膠電泳、超速離心、微流控技術(shù)法和質(zhì)子核磁共振光譜(NMR)等。這些方法流程比較復(fù)雜，檢測時(shí)間長，儀器十分昂貴，檢測成本過高，難以在臨床推廣。VAP+對(duì)LDL-P可有效快速分離且保存原始狀態(tài)，重復(fù)性和分辨率較好也得到部分實(shí)驗(yàn)室和相關(guān)生產(chǎn)廠商的驗(yàn)證和認(rèn)可。其自帶計(jì)算軟件將LDL按體積和密度大小分為A型、B型和AB中間型，較科學(xué)地反映出患者體內(nèi)LDL-P真實(shí)水平，為臨床干預(yù)提供數(shù)據(jù)支持。例如當(dāng)患者標(biāo)本檢測提示LDL-P B型或AB中間型時(shí)，通過apoB的免疫檢測印證，患者外周血中的sd-LDL-P實(shí)際數(shù)量遠(yuǎn)高于正常，需要將LDL-C控制到更低水平[29]。

4 小結(jié)及展望

血脂和脂蛋白的異質(zhì)性和復(fù)雜性導(dǎo)致LDL檢測數(shù)據(jù)在HTG的影響下部分出現(xiàn)偏差，對(duì)心血管疾病的干預(yù)造成負(fù)面影響。因此，臨床對(duì)科學(xué)、準(zhǔn)確的LDL檢測提出了更高要求。VAP+血脂檢測在經(jīng)典的超速離心法基礎(chǔ)上優(yōu)化技術(shù)和流程，較為真實(shí)地反映出血漿脂蛋白的分布狀態(tài)和各組分膽固醇水平(VAP+檢測脂蛋白亞型的應(yīng)用筆者在同類文章中另作說明)，避免高TG帶來的Friedwald公式法誤差；同時(shí)，VAP+對(duì)LDL-P獨(dú)立分析，明確顆粒型別，為臨床提供新的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。

但需要注意的是，目前測定LDL-C和LDL-P的方法眾多，流程均缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，很大程度上造成研究結(jié)果和結(jié)論不一致，對(duì)血脂在臨床疾病診療中的應(yīng)用價(jià)值造成負(fù)面影響。許多醫(yī)生認(rèn)為結(jié)論不確定，則檢測無必要。雖然VAP+技術(shù)在美國已經(jīng)開展20余年積累了很多數(shù)據(jù)，但在中國本土仍缺乏多地區(qū)多中心標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)比試驗(yàn)，本文中就沒有收集到大規(guī)模的同類型產(chǎn)品比對(duì)數(shù)據(jù)。因此，相關(guān)技術(shù)引入的企業(yè)和實(shí)驗(yàn)室更需要在VAP+血脂檢測項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、溯源性和適用性等方面做出努力，明確人群的參考區(qū)間和適用程度，以益于未來流行病學(xué)研究、降脂藥物試驗(yàn)和臨床應(yīng)用的開展；并主動(dòng)適應(yīng)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化建設(shè)的發(fā)展前景，提供更具創(chuàng)新和前瞻性的VAP+血脂檢測模塊。