冷清陽(yáng) 李暢 周建華 劉璐 李娜 龔颯 張浩 李曉華

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 200137

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種在無(wú)過(guò)量飲酒的前提下，以肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯堆積過(guò)多為特征的肝臟疾病，可表現(xiàn)為單純性脂肪性變、非酒精性脂肪性肝炎、纖維化以及肝硬化。目前尚無(wú)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的用于治療NAFLD的藥物，現(xiàn)在臨床上主要采取運(yùn)動(dòng)和改變飲食方式的方法來(lái)對(duì)NAFLD進(jìn)行干預(yù)，但大多數(shù)患者均表示難以長(zhǎng)期堅(jiān)持[1]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新型有效的治療NAFLD的藥物。

二氫楊梅素是中藥藤茶中活性最高的黃酮類化合物。以往研究顯示，其不僅具有黃酮類化合物抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤的作用，而且可以降糖、調(diào)脂、解酒護(hù)肝。但其對(duì)NAFLD的影響研究較少，作用尚不明確。本研究旨在通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)的NAFLD小鼠模型，初步探討二氫楊梅素對(duì)NAFLD的改善作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 60%高脂飼料購(gòu)于美國(guó)Research Diets公司；二氫楊梅素購(gòu)于南京廣潤(rùn)生物制品有限公司；甘油三酯測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)BioVision公司；RIPA(強(qiáng))裂解液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)購(gòu)于美國(guó) Roche 公司；BCATAM蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；脂肪酸合酶(FASN)抗體及熱休克蛋白90抗體(HSP90)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄PrimeScript?RT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)于日本 Takara 公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方案 7周齡的C57BL/6J雄性小鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予60%高脂飼料喂養(yǎng)16周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組[高脂加二氫楊梅素組(HFD+DHM組)]和對(duì)照組[高脂加溶劑組(HFD+Vehicle組)]，每組各15只，HFD+DHM組通過(guò)灌胃的方法給予二氫楊梅素(100 mg·kg-1·d-1)，HFD+Vehicle組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，給藥期間每周測(cè)量體重及進(jìn)食量，給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束共4周。

1.2.2 腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn) 小鼠禁食12 h后進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，按照2 g/kg體重的劑量腹腔注射葡萄糖，并在0、15、30、60、120 min取血測(cè)定血糖水平。

1.2.3 胰島素耐量實(shí)驗(yàn) 小鼠禁食6 h后進(jìn)行胰島素耐量實(shí)驗(yàn)，按照0.75 IU/kg體重的劑量腹腔注射胰島素，并在0、15、30、45、60 min取血，測(cè)定血糖水平。

1.2.4 胰島素釋放實(shí)驗(yàn) 小鼠禁食12 h后進(jìn)行胰島素釋放實(shí)驗(yàn)，按照2 g/kg體重的劑量腹腔注射葡萄糖，并在0、15、30 min取血，測(cè)定胰島素水平。

1.2.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定甘油三酯、總膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

1.2.6 肝組織病理學(xué)觀察(HE染色) 將黃豆大小的新鮮肝臟組織置于4%的多聚甲醛中固定，24 h后依次進(jìn)行梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。包埋好的組織塊進(jìn)行切片，HE染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 肝臟甘油三酯抽提及測(cè)定 稱取30 mg肝臟組織放置于1.5 ml離心管中，加入500 μl的5% NP40，在組織研磨儀上研磨4次(65 Hz，60 s)制成勻漿，85℃水浴5 min，室溫放置10 min，重復(fù)1次，14 000 r/min (r=8.48 cm)離心2 min。取上清100 μl置于新的EP管中。用甘油三酯試劑盒檢測(cè)。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 用Trizol試劑提取肝臟總RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA，用qPCR的方法檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)情況，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.9 蛋白免疫印跡法 小鼠肝臟總蛋白采用RIPA裂解液提取，BCA法測(cè)濃度，加熱變性。取30 μg蛋白樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，5% 脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃搖床過(guò)夜。次日TBST洗膜8 min/次，洗3次，隨后用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠/抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。最后使用 Image Quant凝膠圖像分析儀曝光成像。

2 結(jié)果

2.1 二氫楊梅素對(duì)高脂小鼠體重及糖脂代謝的影響 給藥前兩組體重?zé)o明顯差異，給藥4周后，HFD+DHM組體重明顯低于HFD+Vehicle組(t=2.161，P<0.05，圖1A)，給藥過(guò)程中兩組進(jìn)食量無(wú)明顯改變(圖 1B)。給藥4周后，行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)、胰島素釋放實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，二氫楊梅素可明顯改善高脂喂養(yǎng)小鼠的糖代謝水平(圖1C)和胰島素敏感性(圖 1D)，但胰島功能在兩組間無(wú)明顯變化(圖 1E)。進(jìn)一步檢測(cè)給藥后小鼠血清中甘油三酯和總膽固醇水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予二氫楊梅素喂養(yǎng)后小鼠血清甘油三酯含量較對(duì)照組明顯降低(t=3.343，P<0.05，圖 1F)。血清總膽固醇結(jié)果在兩組間無(wú)明顯變化(圖 1G)。

2.2 二氫楊梅素對(duì)高脂小鼠肝功能的影響 HFD+DHM組血清AST水平(t=2.562，P<0.05，圖 2A)和ALT水平(t=4.293，P<0.01，圖 2B)均明顯低于HFD+Vehicle組。

2.3 二氫楊梅素對(duì)高脂小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響 HFD+DHM組肝重明顯低于HFD+Vehicle組(t=2.803，P<0.05，圖3A，封3)。HE染色結(jié)果顯示，給予二氫楊梅素治療后，小鼠肝細(xì)胞中的脂滴變小、變少(圖3B，封3)，肝脂肪變性減輕。HFD+DHM組肝臟甘油三酯含量明顯低于HFD+Vehicle組(t=7.315，P<0.01，圖 3C，封3)。

2.4 二氫楊梅素對(duì)高脂小鼠肝臟脂代謝相關(guān)分子表達(dá)的影響 HFD+DHM組肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因如FASN(t=7.116，P<0.01)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1，t=7.234，P<0.01)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1，t=5.846，P<0.01)、SREBP-1c(t=3.2，P<0.05)表達(dá)均明顯下調(diào)(圖 4A)，而脂肪酸線粒體氧化相關(guān)的基因，如過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體α(PPARα)、中鏈乙酰輔酶A脫氫酶(MCAD)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT)1、脂酰輔酶A氧化酶(ACOX)表達(dá)則無(wú)明顯變化(圖 4B)。進(jìn)一步檢測(cè)FASN、SREBP-1c蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，二氫楊梅素同樣可以下調(diào)FASN、SREBP-1c的蛋白表達(dá)水平(圖 4C)。

3 討論

NAFLD的發(fā)生與不良的飲食習(xí)慣和不合理的飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。大量研究已顯示，高脂飲食可導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生[2]，且高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD與人類NAFLD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程十分相似，故高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型被廣泛用于NAFLD的研究[3]。本實(shí)驗(yàn)中肝臟HE染色顯示，采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠16周，成功建立NAFLD小鼠模型。

研究表明，二氫楊梅素具有改善NAFLD患者血糖、甘油三酯、膽固醇以及肝功能的作用，但其作用機(jī)制尚不明確[4]。本研究以高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠作為NAFLD模型，研究二氫楊梅素對(duì)NAFLD的改善作用及其潛在機(jī)制。結(jié)果顯示，二氫楊梅素可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠體重，改善其糖脂代謝及肝功能，肝臟HE及甘油三酯含量測(cè)定結(jié)果顯示，二氫楊梅素可以明顯改善肝臟脂肪變性，抑制肝臟脂質(zhì)沉積。

本研究結(jié)果顯示，二氫楊梅素可顯著降低小鼠體重，改善糖代謝和降低血漿中甘油三酯水平。既往研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素可通過(guò)以下兩種途徑改善糖代謝水平：(1)激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMPK)，刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，促進(jìn)葡萄糖攝取。(2)激活胰島素受體/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路，增加葡萄糖6磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表達(dá)，減少葡萄糖生成[5]。在筆者的研究中顯示(未發(fā)表數(shù)據(jù))，二氫楊梅素治療后小鼠體脂含量減少，同時(shí)棕色和腹股溝皮下脂肪中的解耦聯(lián)蛋白1表達(dá)明顯升高，提示二氫楊梅素可激活棕色脂肪和米色脂肪。棕色脂肪和米色脂肪由于富含線粒體以及解耦聯(lián)蛋白1，在寒冷、交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮以及藥物刺激情況下，可燃燒脂滴，將能量以熱能的形式釋放出去，而被稱為產(chǎn)熱脂肪。激活產(chǎn)熱脂肪可增加能量消耗，降低體重，增加胰島素敏感性，改善糖代謝[6]。同時(shí)產(chǎn)熱脂肪的激活也可促進(jìn)甘油三酯的代謝，降低血漿甘油三酯水平[7]。

肝細(xì)胞中甘油三酯的過(guò)度蓄積是NAFLD的顯著特征和起始步驟[8]。肝臟甘油三酯代謝與肝臟脂質(zhì)從頭合成以及脂肪酸氧化分解密切相關(guān)[9]。SREBP-1c是調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)從頭合成途徑最重要的轉(zhuǎn)錄因子，可特異性調(diào)節(jié)脂質(zhì)從頭合成途徑中很多關(guān)鍵酶的表達(dá)，如FASN、ACC1、SCD1等。研究顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟中SREBP-1c表達(dá)明顯上調(diào)，短期抑制SREBP-1c表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)由飲食誘導(dǎo)的NAFLD[10]。FASN是脂肪酸合成的限速酶，抑制FASN的表達(dá)可以減少脂肪酸的合成，改善肥胖引起的NAFLD[11]。本研究結(jié)果顯示，二氫楊梅素可下調(diào)SREBP-1c及其下游與脂質(zhì)從頭合成密切相關(guān)的FASN蛋白的表達(dá)水平，提示二氫楊梅素可通過(guò)抑制脂質(zhì)從頭合成途徑來(lái)減少脂肪酸的合成，從而改善NAFLD。SREBP-1c的表達(dá)受胰島素、AMPK、肝X受體(LXR)、脂肪因子等多種因素的調(diào)控[12-15]。有文獻(xiàn)報(bào)道，二甲雙胍等AMPK激活劑可通過(guò)抑制SREBP-1c表達(dá)，改善脂肪肝[16]。既往研究顯示，二氫楊梅素具有激活骨骼肌中AMPK信號(hào)通路的作用，提示二氫楊梅素可能通過(guò)激活肝臟中AMPK來(lái)抑制SREBP-1c表達(dá)[17]。此外，也有研究證實(shí)，棕色脂肪分泌的脂肪因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4(Nrg4)可通過(guò)激活肝細(xì)胞中的表皮生長(zhǎng)因子受體3(ErbB3)和表皮生長(zhǎng)因子受體4(ErbB4)信號(hào)通路，抑制SREBP-1c的表達(dá)，改善脂肪肝[15]。而筆者研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可激活棕色脂肪，提示二氫楊梅素也可能是通過(guò)作用于棕色脂肪，促進(jìn)Nrg4分泌并激活其下游信號(hào)通路來(lái)調(diào)控SREBP-1c表達(dá)的。當(dāng)然，二氫楊梅素究竟是通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)SREBP-1c表達(dá)的，目前還不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。NAFLD的實(shí)質(zhì)是甘油三酯在肝細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度沉積。肝臟甘油三酯的生成和分解都是影響其含量的主要因素。本研究還檢測(cè)了與脂肪酸β氧化相關(guān)的基因如PPARα、MCAD、ACOX、CPT1等的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素處理之后上述基因表達(dá)無(wú)明顯變化。但Guo等[18]研究顯示，NAFLD大鼠經(jīng)尾靜脈注射二氫楊梅素12周后，肝臟PPARα蛋白和mRNA水平表達(dá)均明顯上調(diào)，提示二氫楊梅素治療后大鼠肝臟組織脂肪酸氧化分解增強(qiáng)。此研究結(jié)果與筆者的結(jié)果不一致，推測(cè)可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種不同有關(guān)，或者是由于給藥時(shí)間長(zhǎng)短不同所致。

血清AST和ALT是肝細(xì)胞損傷的重要生化指標(biāo)，當(dāng)肝功能發(fā)生損傷時(shí)，血清中的AST和ALT水平升高。NAFLD時(shí)，肝臟中的脂質(zhì)沉積、炎性反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡均可引起肝細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，二氫楊梅素可通過(guò)抑制肝臟脂質(zhì)沉積，減少肝細(xì)胞損傷。但也有研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素可以通過(guò)抑制核因子-κB的激活，減少白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等炎性因子的釋放，減輕高脂飲食對(duì)小鼠肝臟造成的炎性損傷；通過(guò)抑制核因子-κB/p53/Bax信號(hào)通路，減少肝細(xì)胞凋亡，保護(hù)肝功能[18]。本研究所發(fā)現(xiàn)的小鼠血清AST和ALT水平降低，可能是二氫楊梅素通過(guò)多個(gè)機(jī)制改善了肝功能的結(jié)果。

綜上所述，本研究表明二氫楊梅素不僅可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠體重，改善其糖脂代謝，而且可以改善肝功能，降低肝臟中脂質(zhì)沉積，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)NAFLD的改善作用。此外，二氫楊梅素通過(guò)降低SREBP-1c/FASN的表達(dá)，抑制肝臟脂質(zhì)從頭合成途徑，減少肝臟脂質(zhì)合成，這可能是其改善NAFLD的重要機(jī)制之一。