袁志鷹 肖青青 李 哲 謝夢(mèng)洲*,3，黃 培 童巧珍 黃惠勇,3

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心湖南長(zhǎng)沙 410208；3.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心湖南長(zhǎng)沙 410208)

盆炎凈是根據(jù)中醫(yī)學(xué)經(jīng)典《普濟(jì)方》研制開發(fā)的中成藥，該藥由忍冬藤、蒲公英、雞血藤、益母草、狗脊、車前草、赤芍、川芎等八味中藥制成[1，2]。盆炎凈有膠囊、片劑和咀嚼劑等劑型，具有清熱利尿、活血通絡(luò)，調(diào)經(jīng)止帶等功效，是臨床最常用婦科疾病中成藥之一[3-5]。中藥成分的復(fù)雜多樣性決定了中藥質(zhì)量控制模式必須采用多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制[6-8]，多指標(biāo)控制能更好的反應(yīng)出中成藥的質(zhì)量。

超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法(UPLC-DAD)可以實(shí)現(xiàn)多種成分的快速分離測(cè)定，可為中藥質(zhì)量控制提供一種簡(jiǎn)單、高效的解決方法[9，10]。盆炎凈膠囊中赤芍的主要指標(biāo)成分為芍藥苷，大車前苷為車前草主要指標(biāo)成分[11，12]，而原兒茶酸是雞血藤、狗脊、川芎、車前草、赤芍和忍冬藤等多種藥材中的重要活性成分[1,13-16]。采用UPLC-DAD快速對(duì)盆炎凈膠囊、片劑、顆粒劑和咀嚼劑中的原兒茶酸，芍藥苷和大車前苷的測(cè)定，可以更好地控制盆炎凈的質(zhì)量，且相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-DAD法快速測(cè)定盆炎凈中成藥中原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷的含量，評(píng)價(jià)不同劑型、不同批次的中成藥盆炎凈質(zhì)量差異，為加強(qiáng)質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity型超高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；KM-250 DE型中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；ML204電子分析天平(瑞士，Mettler Toledo公司)。

乙腈為色譜純(韓國(guó)LG公司)，其余試劑為分析純。水由Millipore純水儀(美國(guó)Millipore公司)制備。

大車前苷(上海源葉生物科技有限公司，B20225)，芍藥苷(上海源葉生物科技有限公司，B21148)，原兒茶酸(上海源葉生物科技有限公司，B21614)。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

收集各批次盆炎凈膠囊、片劑、顆粒劑和咀嚼劑，具體批次詳細(xì)信息如表1所示。

表1 盆炎凈的劑型、批次Table 1 Information of Penyanjing samples

1.3 溶液制備

1.3.1 供試品溶液的制備取盆炎凈膠囊內(nèi)容物、顆粒劑、片劑和咀嚼片，用研缽研碎，分別稱取約0.25 g(準(zhǔn)確稱定)，放入具塞的錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱定重量。超聲30 min后，取出冷卻至室溫，用70%甲醇補(bǔ)足超聲過(guò)程中減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

圖1 盆炎凈樣本中原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard solution and test solution1.Standard solution(230 nm);2.Test solution.(230 nm).

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷對(duì)照品適量，用70%甲醇溶解，得到原兒茶酸為31.88 μg/mL、芍藥苷為57.14 μg/mL、大車前苷為48.81 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.4 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)和0.2%磷酸溶液(B)；梯度洗脫:0～1.9 min，10%(A)；1.9～2.0 min，10%～20%A；2.0～3.5 min，20%～25%A；3.5～3.9 min，25%～35%A；3.9～4.5 min，35%～50%A；4.5～5.5 min，50%～60%A；5.5～6.5 min，60%～90%A；6.5～9.0 min，90%～10%A；9.0～10.0 min,10%A。流速0.15 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量2.0 μL，柱溫30 ℃。優(yōu)化條件下盆炎凈中原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷色譜譜圖見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)根據(jù)3種主要活性成分的性質(zhì)，對(duì)供試品溶液的提取溶劑進(jìn)行了篩選。對(duì)提取溶劑50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇、70%甲醇進(jìn)行了提取效果的比較。結(jié)果表明，以70%甲醇為提取溶劑的提取效果最好，故選定70%甲醇作為提取溶劑。

2.2 梯度洗脫條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸等不同比例流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫的效果。結(jié)果表明，原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷的測(cè)定在乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相，按1.4節(jié)下梯度條件洗脫，3種活性成分峰保留時(shí)間適中，分離度和峰形最佳。將混合對(duì)照品溶液用DAD進(jìn)行全波長(zhǎng)條件掃描，經(jīng)分析可知3種成分在波長(zhǎng)230 nm均具有較大的吸收強(qiáng)度，峰形好，故選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 樣品中3種主要成分含量的比較分析

實(shí)驗(yàn)對(duì)不同劑型盆炎凈中的原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷進(jìn)行了多批次的含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同批次盆炎凈膠囊樣品中的3種主要活性成分含量存在差異(圖2)。從分布水平來(lái)看，所有的樣本均含有芍藥苷，因此芍藥苷可以作為中成藥盆炎凈的重點(diǎn)關(guān)注質(zhì)控成分。

圖2 盆炎凈樣本中原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷含量分布圖(橫坐標(biāo)1～25為樣本編號(hào))Fig.2 Amount distribution charts of protocatechuic acid,paeoniflorin and plantamajoside in samples of Penyanjing

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系精密吸取對(duì)照品溶液，稀釋得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液。分別吸取上述稀釋后的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行UPLC-DAD檢測(cè)。以對(duì)照品溶液的濃度c為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得到各活性成分的線性方程。結(jié)果見表2，各活性成分的線性良好。

表2 各組分的線性方程Table 2 Linear equation of different compounds

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)按照優(yōu)化色譜條件，取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.62%、0.36%、0.45%，精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液，分別于0、1、2、5、7、10、13、24 h進(jìn)樣測(cè)定，原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷峰面積的RSD分別為0.37%、1.32%、0.74%，顯示穩(wěn)定性良好。

2.4.4 加標(biāo)回收率平行取已知3種活性成分含量的盆炎凈膠囊內(nèi)容物9份，研缽研碎，精密稱定每份約0.25 g，分成3組，每組3份。每組分別加入混合對(duì)照品溶液1、2、3 mL，加入70%甲醇定容至25 mL，超聲30 min，進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算樣品加樣回收率。結(jié)果顯示原兒茶酸、芍藥苷、大車前苷和加樣回收率分別為103.40%、98.81%、93.70%，RSD分別為2.68%、2.34%、2.83%，表明回收率良好。結(jié)果詳見表3。

2.5 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取不同批次的盆炎凈樣品，按1.3方法制備供試品溶液，按1.4色譜條件進(jìn)行測(cè)定，被測(cè)組分原兒茶酸、芍藥苷、大車前苷與共存組分實(shí)現(xiàn)基線分離，計(jì)算樣品中原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷的含量，結(jié)果見表4。

表3 盆炎凈中原兒茶酸、芍藥苷和大車前苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 Rerults of recovery tests(n=3)

表4 盆炎凈樣品主要活性成分含量(n=3)Table 4 Determination of bioactive compounds in Penyanjing(n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)收集的25批次盆炎凈樣本來(lái)源于多個(gè)廠家，3種主要活性成分含量的差異可能與廠家制備工藝和藥材本身因素有關(guān)，而盆炎凈4種劑型目前只有企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，提高盆炎凈企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)十分迫切。我們將加強(qiáng)對(duì)中成藥盆炎凈的研究，為提高其質(zhì)量監(jiān)督提供依據(jù)。