禹新良

(1.湖南工程學(xué)院環(huán)境催化與廢棄物再生化湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖南湘潭 411104；2.湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖南長(zhǎng)沙 410082)

核酸適配體(Aptamer)是單鏈寡核苷酸，它能結(jié)合特定的生物靶標(biāo)，如蛋白質(zhì)分子、細(xì)胞、病毒[1，2]。與抗體相比，核酸適配體具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括合成簡(jiǎn)單、體外修飾容易、免疫原性小、易于穿透腫瘤組織等[3,4]。核酸適配體的出現(xiàn)，為探索重大疾病早期診斷及靶向治療方法開(kāi)辟了嶄新的途徑[5，6]。因此，核酸適配體相關(guān)技術(shù)的研發(fā)已經(jīng)成為化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。

核酸適配體可采用以細(xì)胞為靶標(biāo)的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(Cell-SELEX)技術(shù)獲得，從人工合成的DNA/RNA文庫(kù)中篩選得到，即通過(guò)重復(fù)的寡核苷酸序列與標(biāo)靶的吸附分配、寡核苷酸序列與標(biāo)靶復(fù)合物洗脫、回收，以及聚合酶鏈擴(kuò)增3個(gè)基本步驟，從單鏈寡核苷酸文庫(kù)中篩選出能與靶標(biāo)特異性結(jié)合的DNA/RNA適配體[7，8]。

成功的適配體SELEX篩選實(shí)驗(yàn)通常循環(huán)次數(shù)多，且每輪循環(huán)操作耗時(shí)、耗力、耗材[9]。基于分子構(gòu)效關(guān)系(QSAR/QSPR)模型方法可以用于分子性質(zhì)的估算，然后將最有希望滿足某種性能要求的分子用于實(shí)驗(yàn)室的合成與測(cè)試[10]。因此，核酸適配體分子構(gòu)-效關(guān)系研究可以節(jié)約資源、促進(jìn)新型適配體開(kāi)發(fā)。每年關(guān)于分子構(gòu)效關(guān)系的研究報(bào)道超過(guò)5 000篇[11]，通常這些研究基于的分子參數(shù)是直接從研究的分子體系計(jì)算而得。由于核酸適配體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的缺乏，尤其是核酸適配體分子結(jié)構(gòu)參數(shù)提取的困難，目前對(duì)核酸適配體開(kāi)展構(gòu)-效關(guān)系研究的報(bào)道極少。Musafia等人[12]采用簡(jiǎn)單的拓?fù)鋮?shù)，對(duì)識(shí)別流感病毒的核酸適配體的親和性進(jìn)行構(gòu)-效關(guān)系研究，模型訓(xùn)練集、測(cè)試集相關(guān)系數(shù)R2分別為0.702、0.66。另外，我們課題組對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞核酸適配體中心序列形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)(即環(huán)結(jié)構(gòu))開(kāi)展計(jì)算，將得到參數(shù)建立親和性、專一性的分類模型，其模型的精度高、預(yù)測(cè)能力強(qiáng)[9]。

前列腺癌(Prostate Carncer，PCa)是最常見(jiàn)的、嚴(yán)重威脅男性健康的惡性腫瘤之一[2,6,13，14]，而目前還缺乏對(duì)前列腺癌有效的早期診斷方法。因此，對(duì)前列腺癌細(xì)胞的核酸適配體開(kāi)展構(gòu)-效關(guān)系研究，有利于開(kāi)發(fā)適配體分子識(shí)別探針，促進(jìn)適配體應(yīng)用于前列腺癌早期診斷與治療[5,6]。本研究擬采用間接分子參數(shù)提取模型計(jì)算參數(shù)，建立以前列腺癌PC-3M-1E8為靶細(xì)胞的核酸適配體構(gòu)-效關(guān)系模型。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

本研究采用以前列腺癌PC-3M-1E8為靶細(xì)胞，通過(guò)Cell-SELEX方法得到候選核酸適配體[6]。單鏈DNA文庫(kù)(5′-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-N40-TATCAGTGGTCGGTCGTCAT-3′)制備時(shí)，熒光標(biāo)記的正向引物為：FP-FAM，5′-FAM-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-3′；生物素標(biāo)記的反向引物為：RP-Biotin，5′-Biotin-ATGACGACCGACCACTGATA-3′。而未做任何標(biāo)記的、用于克隆測(cè)序的正向引物為：FP，5′-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-3′；反向引物為：RP，5′-ATGACGACCGACCACTGATA-3′。所用到的全部序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成純化；前列腺高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞PC-3M-1E8及前列腺低轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞PC-3M-2B4均由中國(guó)科學(xué)院上海科學(xué)研究院提供。以前列腺高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞PC-3M-1E8進(jìn)行正篩選，從第4輪開(kāi)始引入反篩選，選擇前列腺低轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞PC-3M-2B4作為對(duì)照細(xì)胞，以此減少非特異性吸附，提高篩選效率。

經(jīng)12輪SELEX篩選，DNA文庫(kù)與PC-3M-1E8細(xì)胞的結(jié)合力達(dá)到飽和，且文庫(kù)中核酸序列的富集度高。SELEX實(shí)驗(yàn)的第3、5、7、9、11輪產(chǎn)品序列采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)序。

分別選取第3、5、7、9、11輪產(chǎn)品中，中心序列堿基為40±1，且富集水平最高的各100條序列作為研究對(duì)象。其中第3輪中與11輪重復(fù)的序列予以剔除，保證第3輪的100條序列與第11輪的100條序列不出現(xiàn)重復(fù)。由于對(duì)第12輪產(chǎn)品測(cè)序的序列少，不具有代表性，且與第11輪序列重復(fù)，因此本文沒(méi)有對(duì)12輪序列單獨(dú)進(jìn)行分析。

隨機(jī)地將第3、11輪篩選所得的序列各自的3/4(75條)作為訓(xùn)練集，建立分類模型；各自剩下的1/4(25條)作為測(cè)試集，對(duì)分類模型進(jìn)行檢驗(yàn)。所得模型同時(shí)對(duì)第5、7、9輪所得序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。將第3輪的100條序列類標(biāo)簽值(或目標(biāo)值)設(shè)置為“1”，代表低親和性、低特異性的候選核酸適配序列；將第11輪篩選所得核酸序列類標(biāo)簽值設(shè)置為“2”，代表高親和性、高特異性候選核酸適配序列。

1.2 分子參數(shù)計(jì)算

通常，QSAR/QSPR模型所用的分子參數(shù)直接從分子結(jié)構(gòu)計(jì)算得到?；贒NA(或RNA)核酸適配體堿基序列的一維分子參數(shù)在本質(zhì)上是拓?fù)鋮?shù)，與基于分子二維、三維結(jié)構(gòu)參數(shù)相比，缺乏對(duì)適配體分子的電子、幾何等特征的精確反映[9]。由于核酸適配體序列分子較大，直接計(jì)算分子二維、三維結(jié)構(gòu)參數(shù)存在困難，包括分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化存在困難，以及參數(shù)提取存在困難。如最常用的分子參數(shù)提取軟件Dragon[15]，不能用于核酸適配體(15～45堿基)的分子參數(shù)計(jì)算。

分子參數(shù)的實(shí)質(zhì)是將分子的結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)換成數(shù)字特征。由于基因堿基序列隱含著氨基酸序列信息，即基因片段結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。而QSAR/QSPR研究的實(shí)質(zhì)就是建立分子性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系式；核酸適配體性質(zhì)與其序列結(jié)構(gòu)有關(guān)聯(lián)，而后者又與相應(yīng)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。我們課題組已經(jīng)成功采用DNAMAN 6.0軟件將抗流感病毒核酸適配體序列翻譯成氨基酸序列，計(jì)算氨基酸序列的分子參數(shù)，然后用這些分子參數(shù)建立抗流感病毒核酸適配體親和性構(gòu)效關(guān)系模型[16]。這種方法用于本文的分子參數(shù)計(jì)算。

在建立QSAR/QSPR模型時(shí)，理論上講分子參數(shù)越精確越好。由于本文參數(shù)計(jì)算模型是從核酸序列翻譯而來(lái)，因此這種計(jì)算模型本身帶有近似性。采用半經(jīng)驗(yàn)或分子力學(xué)等方法對(duì)分子進(jìn)行優(yōu)化、計(jì)算得到分子參數(shù)，用于構(gòu)-效關(guān)系研究是可行的。因?yàn)椴捎没貧w分析時(shí)，分子參數(shù)中的系統(tǒng)誤差可以降低或消除。本文的二元分類模型與回歸模型在本質(zhì)上是一樣的，只是分類模型將回歸模型的輸出離散化。因此，本文在計(jì)算氨基酸序列分子參數(shù)時(shí)，采用ChemBioDraw 11.0構(gòu)建分子結(jié)構(gòu)，接著使用ChemBio3D 11.0的分子力學(xué)(MM2)方法優(yōu)化，收斂標(biāo)準(zhǔn)為均方根誤差小于0.42 kJ/mol?。然后采用Dragon 6.0軟件[15]，為每條氨基酸序列計(jì)算4 885個(gè)分子參數(shù)。將分子參數(shù)為常數(shù)，或分子參數(shù)之間相關(guān)性大于0.90的參數(shù)予以剔除，最后從每條氨基酸序列得到747個(gè)分子參數(shù)。

2 結(jié)果和討論

2.1 分類模型建立

采用IBM SPSS Statistics 19的向前逐步(Forward Wald)方法對(duì)第3、11輪的200條候選核酸適配體序列類標(biāo)與相應(yīng)氨基酸序列分子參數(shù)進(jìn)行二元Logical回歸分析，得到分類回歸表和變量特征表，分別見(jiàn)表1和表2。表1顯示，模型(Model) 7含有7個(gè)分子參數(shù)(定義見(jiàn)表3)，模型類標(biāo)(Class)1、類標(biāo)2的分類準(zhǔn)確率分別是79%、81%，平均準(zhǔn)確率為80%，模型預(yù)測(cè)理想。表2顯示，模型7中所有變量Sig.值小于0.05，表明7個(gè)分子參數(shù)均有統(tǒng)計(jì)意義?；谏鲜?個(gè)分子參數(shù)的二元Logical回歸模型，對(duì)訓(xùn)練集進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)第311輪序列預(yù)測(cè)總的準(zhǔn)確率均為80.0%。

由于本文用“1”、“2”代表核酸適配體親和性高低，屬于典型的二分法研究。而支持向量機(jī)分類(SVC)算法被認(rèn)為是針對(duì)小樣本統(tǒng)計(jì)估計(jì)和預(yù)測(cè)學(xué)習(xí)的最佳理論，在分類建模中取得了理想的結(jié)果[9]，因此本文進(jìn)一步采用SVC用來(lái)建立更為精確分類模型。將從第3、11輪得到的各100條核酸序列隨機(jī)分成測(cè)試集與訓(xùn)練集，每輪中3/4的序列作為訓(xùn)練集，余下的樣本作為測(cè)試集。用高斯徑向基函數(shù)(RBF)作為SVC的核函數(shù)，模型最佳正則化常數(shù)C與Gaussian函數(shù)參數(shù)γ采用粒子群優(yōu)化(PSO)算法搜尋。

實(shí)驗(yàn)中使用的參數(shù)值設(shè)置如下：認(rèn)知學(xué)習(xí)因子c1初始值和社會(huì)學(xué)習(xí)因子c2初始值設(shè)置分別為1.5、1.7；種群最大數(shù)量為20；最大迭代次數(shù)為200；SVM參數(shù)搜索范圍C是100～1 000；SVM參數(shù)γ搜索范圍是0.01～1.0。建模時(shí)采用留一法(LOO)進(jìn)行交叉驗(yàn)證。采用LIBSVM在MATLAB R2012a平臺(tái)上建立SVC模型。結(jié)果顯示，相對(duì)最佳的SVC模型參數(shù)C和γ分別是C=357.7和γ=0.011；SVC模型對(duì)訓(xùn)練集的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為87.3%，其中第3輪核酸序列預(yù)測(cè)精度為86.7%，第11輪核酸序列的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為88.0%；對(duì)測(cè)試集的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為86.0%，其中第3輪序列預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為88.0%，第11輪序列的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為84.0%。對(duì)第3輪與第11輪序列預(yù)測(cè)總的準(zhǔn)確率均為87.0%?；谙嗤臄?shù)據(jù)集，用二元Logical回歸分析時(shí)，對(duì)第3輪與第11輪序列預(yù)測(cè)總的準(zhǔn)確率均為80.0%。很明顯，SVC分類模型優(yōu)于二元Logical回歸分類模型。

2.2 模型參數(shù)討論

表3中第1個(gè)分子參數(shù)LEB屬于Burden特征值(Burden Eigenvalues)參數(shù)組，該組分子參數(shù)基于Burden提出的一種用改進(jìn)的鄰接矩陣計(jì)算參數(shù)方法。此矩陣中，對(duì)角元素的原子性質(zhì)的計(jì)算要折合成C元素的性質(zhì)，非對(duì)角元素與成鍵原子對(duì)的鍵級(jí)有關(guān)。Dragon能提供基于Burden矩陣的、8個(gè)具有最大特征值及8個(gè)最小特征值的分子參數(shù)。已經(jīng)證實(shí)Burden特征值參數(shù)可以反映分子的有關(guān)結(jié)構(gòu)特征，并用于分子結(jié)構(gòu)相似性或差異性的區(qū)分[15]。

第2個(gè)分子參數(shù)SME屬于邊鄰接指數(shù)(Edge Adjacency Indices)。邊鄰接指數(shù)本質(zhì)上為拓?fù)鋮?shù)，是基于隱氫分子圖的鄰接矩陣計(jì)算而來(lái)，反映分子圖形邊相連信息。矩陣的維數(shù)與取決于非氫原子形成的化學(xué)鍵數(shù)目，當(dāng)化學(xué)鍵相鄰或不相鄰時(shí)，矩陣中對(duì)應(yīng)的元素為1或0。當(dāng)鄰接矩陣的零對(duì)角元素用具體的化學(xué)鍵性質(zhì)取代時(shí)，形成的增廣邊鄰接矩陣可描述具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。用于加權(quán)處理的化學(xué)鍵性質(zhì)包括與共振積分有關(guān)的參數(shù)(Parameters Related to the Resonance Integral)、鄰邊數(shù)目(Edge Degree)、鍵級(jí)(Conventional Bond Order)、偶極矩(Dipole Moment)。分子參數(shù)SME能反映分子的幾何特征等結(jié)構(gòu)信息。

第3個(gè)分子參數(shù)MVV為采用van der Waals體積加權(quán)處理的3D-MoRSE參數(shù)[15]。這類參數(shù)表示在各個(gè)方向的電子散射強(qiáng)度。分子參數(shù)MVV能反映分子三維結(jié)構(gòu)等信息，也具有區(qū)分同系列分子結(jié)構(gòu)的相似性或差異的能力[9,15]。

第4個(gè)分子參數(shù)NSA為脂肪族化合物中含仲酰胺基團(tuán)數(shù)目；第5個(gè)分子參數(shù)FNN為鍵的拓?fù)渚嚯x為5出現(xiàn)N-N鍵的頻率；第6個(gè)分子參數(shù)FCO為鍵的拓?fù)渚嚯x為6出現(xiàn)C-O鍵的頻率；最后1個(gè)分子參數(shù)FCS為鍵的拓?fù)渚嚯x為7出現(xiàn)C-S鍵的頻率。

表1 基于二元Logical回歸分類表Table 1 Classification table with binary logical regression analysis

表2 模型所用分子參數(shù)特征Table 2 Characteristics of descriptors appearing in model

(續(xù)表2)

ModelDescriptorBhS.E.iWalsjdfkSig.lExp(B)mModel6fLEB126.42754.8105.32110.0218.067E54SME1.8900.58510.43110.0016.621MVV-0.4950.13513.49210.0000.609NSA0.7790.2658.68110.0032.180FCO-0.3350.05044.65210.0000.715FCS-0.3430.1198.31310.0040.709Constant-949.942407.2765.44010.0200.000Model7gLEB124.84957.9594.64010.0311.664E54SME2.3710.63214.06710.00010.704MVV-0.7060.15919.71910.0000.494NSA0.8340.2759.19510.0022.302FNN-0.4470.1489.07910.0030.640FCO-0.3740.05644.82610.0000.688FCS-0.4170.12610.91710.0010.659Constant-940.762430.7594.77010.0290.000

aVariable(s) entered on Model 1:FCO.bVariable(s) entered on Model 2:MVV.cVariable(s) entered on Model 3:FCS.dariable(s) entered on Model 4:LEB.eVariable(s) entered on Model 5:SME.fVariable(s) entered on Model 6:NSA.gVariable(s) entered on Model 7:FNN.hB is Logistic regression coefficients;iS.E.is the standard error;jWals is the statistic;kdf is degree of freedom;lsig.is p-value test;andmExp(B) is the odds ration.

表3 分子參數(shù)符號(hào)、定義與分類Table 3 The symbol,definition and class of molecular descriptors selected

2.3 分類模型討論

在SELEX篩選中，開(kāi)始時(shí)核酸適配體親和性較?。浑S著篩選輪數(shù)的增加，親和性開(kāi)始迅速增大；而隨著SELEX篩選輪數(shù)繼續(xù)增加時(shí)，親和性增大變得緩慢。親和性達(dá)到一個(gè)飽和點(diǎn)之后，隨著篩選輪數(shù)的進(jìn)一步增加，親和性增加并不明顯。因此，本研究將從第3輪篩選獲得的候選核酸序列類標(biāo)簽值設(shè)置為“1”(代表低親和性和低特異性候選核酸適配)，而把從第11輪篩選所得序列類標(biāo)簽值設(shè)置為“2”(表示高親和性和高特異性候選核酸適配)是合理的。

本文模型LOO交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率高(76%)；測(cè)試集與訓(xùn)練集的準(zhǔn)確率接近；且SVC模型最佳正則化常數(shù)C(=357.7)及Gaussian函數(shù)參數(shù)γ(=0.011)相對(duì)較小，模型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。因此本文所建模型不存在過(guò)擬合。

將SVC模型對(duì)第5、7、9輪的序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)，含類標(biāo)“2”的樣本分別是41、61、64條。通常在SELEX實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，當(dāng)靶標(biāo)分子數(shù)目遠(yuǎn)小于核酸的序列數(shù)目時(shí)，候選核酸適配體序列與靶標(biāo)結(jié)合的親和性隨篩選輪數(shù)的增加而增大。因此本文預(yù)測(cè)的第3、5、7、9、11輪含類標(biāo)值為“2”(高親和性、高專一性)的樣本分率逐漸增大，分別是0.32、0.41、0.61、0.64、0.87，這與核酸適配體進(jìn)行規(guī)律一致。

基于模型預(yù)測(cè)，表4中的4條序列應(yīng)該為高親和性、高特異性的核酸適配體。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表4顯示核酸適配體序列Xq1、Xq2、Xq3、Xq4與標(biāo)靶PC-3M-1E8及PC-3M-2B4結(jié)合解離常數(shù)為2～47 mmol[6]，預(yù)測(cè)結(jié)果非常滿意。

表4 基于分類模型驗(yàn)證的4條候選序列Table 4 Four candidate aptamers validated with classification model

目前流行的核酸序列分類(如序列同源性比對(duì))是基于序列的相似性。我們應(yīng)用DNAStar軟件包中MegAlign軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)集第3、11輪核酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，比對(duì)方法為ClustalW。根據(jù)SELEX篩選特點(diǎn)，隨著篩選輪數(shù)的增加，產(chǎn)品中核酸序列的相似性也會(huì)增加，即進(jìn)化樹(shù)中相似性最大的序列應(yīng)該主要由第11輪的序列組成。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，相似性最大的84條序列中，僅有50條序列來(lái)自第11輪篩選所得的產(chǎn)品，分類準(zhǔn)確率接近60%。此結(jié)果低于本文SVC模型預(yù)測(cè)總的準(zhǔn)確率(87.0%)。因此，目前基于序列相似性進(jìn)行比對(duì)的算法，不能實(shí)現(xiàn)本文核酸序列親和性高、低兩類的區(qū)分。其原因是基于序列相似性的比對(duì)分析，所利用的信息是序列中堿基的排列順序與位置，該方法的實(shí)質(zhì)是利用了序列的一維拓?fù)湫畔?；而本文的分類方法是基于序列的三維結(jié)構(gòu)信息。因此本文分類方法與目前流行的分類方法在基于的序列結(jié)構(gòu)信息方面有著本質(zhì)區(qū)別。

QSAR/QSPR研究的主要目的是建立起分子結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系式。由于核酸適配體序列結(jié)構(gòu)與其翻譯后的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)，即適配體序列化學(xué)結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的氨基酸序列化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。因此從氨基酸計(jì)算得到的7個(gè)分子參數(shù)隱含著核酸適配體的結(jié)構(gòu)信息，由這些分子參數(shù)建立的二元回歸模型可以用于核酸適配體序列親和性、專一性的預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

本文成功建立了以前列腺癌PC-3M-1E8細(xì)胞為標(biāo)靶的核酸適配體親和性的SVC模型，模型對(duì)訓(xùn)練集(150條核酸序列)、測(cè)試集(50條核酸序列)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度分別為87.3%和86%。SVC模型對(duì)SELEX篩選實(shí)驗(yàn)的第3、5、7、9、11輪的核酸適配體進(jìn)行了預(yù)測(cè)，其中高親和性與高特異性核酸適配體的分率分別是0.23、0.41、0.61、0.64、0.87，預(yù)測(cè)結(jié)果符合SELEX篩選的適配體進(jìn)行規(guī)律。因此，間接從氨基酸序列計(jì)算分子參數(shù)、建立模型，預(yù)測(cè)以前列腺癌PC-3M-1E8細(xì)胞為標(biāo)靶的核酸適配體親和性是可行的。