楊榮志 譚 君 楊華勇 吳 鋼 余康進 楊俊品

（1 阿壩州農業(yè)科學技術研究所，四川馬爾康 624000；2 四川省農業(yè)科學院作物研究所，成都 610000）

玉米是我國主要的糧飼兼用作物，尤其是在農業(yè)生產條件較差的高原地區(qū)和高寒山區(qū)，玉米生產在糧食穩(wěn)定中的地位更加突出。中緯度高原地區(qū)由于特殊的地理條件和人們對飲食的需求，需要生育期短、品質優(yōu)的玉米品種；傳統(tǒng)選育在材料上具有較強的獨立性，外來資源少，對本地區(qū)地方種質資源的依賴性較大，但長期以來較為單一的雜交模式給玉米育種工作的突破帶來了難度[1-2]。

近年來，隨著現(xiàn)代分子標記技術在農作物研究中的成熟應用，各地利用分子標記技術研究玉米種質資源遺傳多樣性的報道很多[3-4]，但中緯度高原地區(qū)中早熟玉米種質資源作為特殊的遺傳類型，分子水平研究報道較少[5]。本研究利用SSR 分子標記技術，對27 份川西高原傳統(tǒng)利用和新近育成的中早熟玉米自交系以及5 個標準測驗種進行研究，分析種質資源間的遺傳關系，在此基礎上建立雜種優(yōu)勢群，為這一地區(qū)今后的玉米育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試材料包括川西高海拔地方種質的自交系或地方種質改良自交系9 份，外來血緣選育的中早熟自交系13 份，引進中早熟自交系5 份，以及我國主要玉米雜優(yōu)模式群體代表自交系5 份（表1）。

1.2 試驗方法試驗于2016 年進行。在玉米1～2 葉幼苗期剪取莖葉，采用國際水稻研究所提出的CTAB法提取DNA。PCR 擴增反應及產物檢測：反應體系15μL，其中含1×Buffer，2.5mmol/L MgCl2，0.4mmol/L dNTP，SSR 引物（前引物和后引物）各3.3ng/μL，0.5U Taq DNA 聚合酶，70ng DNA 模板。反應程序采 用SSRMethod（http：//www.agron.missouri.edu）提供的方法，95℃預變性10min，1 個循環(huán)；95℃變性1min，65℃退火1min（以后每個循環(huán)降低1℃），72℃ 1.5min，11 個降溫循環(huán)；95℃變性1min，55℃1min，72℃ 1.5min，共30 個循環(huán)；最后在72℃延伸10min。反應結束后，用4.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳在1×TAE 緩沖液中恒定85W 電泳45min，然后銀染和顯影照相。

表1 32 個自交系名稱及系譜來源

1.3 數(shù)據(jù)分析根據(jù)引物擴增和電泳分離結果，建立SSR 的0-1 數(shù)據(jù)庫，每一個引物檢測一個染色體位點，每一個條帶視為一個等位基因，在相同遷移位置上（相同的分子量片段）有帶的記為1，無帶的記為0，缺失的記為9。采用Jaccard 系數(shù)的方法計算遺傳距離（GD，genetic distance），遺傳相似系數(shù)（GS，genetic similarity）GS=1-GD，采用類平均法（UPGMA）進行聚類作圖[6-7]，數(shù)據(jù)處理用DPS7.55 完成。

2 結果與分析

2.1 SSR 標記檢測結果本研究應用74 對SSR 引物對32 個玉米自交系進行擴增，其中63 對引物多態(tài)性好、帶型穩(wěn)定，其余11 對引物因為擴增效果較差，不能進行統(tǒng)計。統(tǒng)計的63 對SSR 引物分布于玉米10 條染色體上[6-8]，共檢測出298 個等位基因變異，每個引物檢測到2～10 個等位基因，平均每個位點檢測到的等位基因數(shù)為4.73 個。在10 條染色體上分別檢測了7、5、9、5、6、6、5、6、5、9 個位點，分別檢測出36、20、37、25、32、35、21、28、17、47 個等位基因（表2）。圖1 為引物umc1506 對32 個自交系的擴增圖譜。

2.2 遺傳距離利用Jaccard 法計算得到32 個玉米自交系的SSR 遺傳距離范圍是0.31～0.79，平均遺傳距離為0.55，表明供試的玉米自交系存在較大的遺傳差異。

2.3 聚類分析根據(jù)32 個自交系的SSR 遺傳差異系數(shù)矩陣，利用UPGMA 法進行聚類分析，結果如圖2 所示。在遺傳距離0.75 處，32 個自交系可以分為5 類，在遺傳距離0.73 處，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類又各分為2 個亞類，各類包含的自交系見表3。

從系譜親緣關系分析，SSR 聚類結果與系譜追蹤具有較好的一致性。其中，沃30 和沃抗L 都是來源于阿壩州純地方資源沃日抗旱玉米，92115、8111沃、97-81 都是沃30 的改良系，不同程度含有該地方血緣，試驗結果也表明它們之間遺傳距離小，聚為一類；LBH-71、LMB-72 是涼山州兩個地方種質的改良系，結果也和沃30 等自交系共同聚在第Ⅰ類，而第Ⅰ類中沒有其他外來自交系和標準測驗自交系歸入，說明川西高海拔地區(qū)地方種質資源遺傳類群相對獨立。丹340 和330 在聚類結果中歸為一類，與前人相關研究報道一致[9-10]，汶頂313 是汶川白玉米和330 的雜交后代，和330、丹340 一起聚在第Ⅱ類1 亞類；在第Ⅱ類2 亞類中，41、41330、9-432都含有Mo17 血緣，阿自50 是41 和1034 的雜交后代，聚在一起比較合理，4H43、4643 都是446 和oh43 的雜交后代，和Mo17 聚在一類的原因有待進一步研究。JZ-223、MA17、D616 都是國外中早熟雜交種選育的自交系，試驗結果同聚于第Ⅲ類1 亞類；P6113 和47813 同有太系113 血緣，47813 又有478 血緣，和478 一起歸在第Ⅲ類2 亞類。卡142、早28 都是加拿大早熟雜交種選育的自交系，歸在第Ⅳ類；WO98是丹598的后代，兩自交系聚在第Ⅴ類；9021、6131、8641、2417、216 為新引進自交系，親緣關系不詳，分別被聚到不同的類群中。

表2 63 對SSR 引物在32 個玉米自交系中檢測到的基因數(shù)

3 討論

3.1 中緯度高海拔地方種質資源研究與利用目前，我國玉米育種在資源利用上絕大部分還是以蘭卡斯特、瑞德、旅大紅骨、唐四平頭、PN 等為主[9-10]，遺傳基礎比較狹窄，眾多的地方資源沒有得到有效利用[11]。通過本研究的SSR 聚類結果可以看出，供試的中緯度高海拔地方種質資源不能歸入國內目前主要應用的雜種優(yōu)勢群體，屬于一個相對獨立的遺傳群體，因此可以推測，高原中早熟地方種質與我國主要的雜種優(yōu)勢群體都應有較好的雜種優(yōu)勢。高海拔地區(qū)生態(tài)氣候復雜，土地干旱瘠薄，地方玉米種質在當?shù)鼐哂羞m應性好、品質優(yōu)等外來血緣不具備的優(yōu)點，但是在育種實踐中也發(fā)現(xiàn)，多數(shù)高原地方種質資源抗病抗倒性較差，抗性、株型等缺陷難以保障在生產中直接利用[12-13]。因此可以根據(jù)本研究的聚類結果引入外來種質資源對地方種質進行定向改良，同時還應加強其他地方資源的收集和研究工作。

表3 32 個玉米自交系的SSR 聚類結果

3.2 SSR 聚類結果在雜種優(yōu)勢利用實踐中的體現(xiàn)供試的中早熟自交系中有6 個自交系已經在中緯度高海拔地區(qū)組配出雜交組合并通過品種審定應用于生產，其中地方資源沃30 組配出了阿單4 號（oh43×沃30）、阿單8 號（41×沃30）、金單四號（沃30×Mo17），92115 組配出了阿單9 號（446×92115）、阿單11 號（阿自50×92115），8111沃組配出了阿單12 號（Mo17×8111 沃）、阿單14號（41×8111 沃），這些組合多數(shù)都是高原地方種質與蘭卡斯特種質的優(yōu)勢體現(xiàn)，也與本研究中高原地方種質獨立于蘭卡斯特群體的結果吻合。

3.3 本研究成果對今后高原玉米育種的指導和設想高原地方種質相對獨立，因此在以后的育種實踐中，還應加強該類群同瑞德等其他雜種優(yōu)勢群的利用研究。另一方面，新育成和新引進的自交系在本研究中進行了明確歸類，今后要利用這一研究成果并結合田間配合力測定等工作為中緯度高海拔地區(qū)玉米育種提供指導。