趙 晨，洪誠毅，林鄭忠，黃志勇

集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021

引 言

孔雀石綠(MG，C23H25CN2)是一種有毒的三苯甲烷類染料，它可以殺死真菌、細(xì)菌和寄生蟲[1]。由于其價(jià)格低廉以及高效的抑菌作用，孔雀石綠曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。然而，長期大量的使用孔雀石綠將會(huì)對人產(chǎn)生致癌、致畸、致突變的危害。因此，歐盟、加拿大、美國和中國等國家或地區(qū)已經(jīng)禁止MG在動(dòng)物性食品中使用。由于具有顯著的抑菌作用，MG仍然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被非法使用，需要發(fā)展一種快速、靈敏、高效的MG檢測方法。目前MG的檢測方法有以下兩類，一類是基于大型儀器設(shè)備的檢測方法，例如高效液相色譜法(HPLC)[2]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[3]和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)，這些方法均需要相對復(fù)雜的預(yù)處理，耗時(shí)長且依賴于昂貴的大型儀器，檢測極為不便。另一類是利用光譜檢測法，例如酶聯(lián)免疫法(ELISA)[4]，但是這種方法需要制備抗體，且檢測條件苛刻；熒光檢測法[5]，但熒光不穩(wěn)定，耗時(shí)較長。因此，研究一種能夠簡便快速的檢測方法很有必要。

核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)篩選出來的一種能與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的DNA或RNA片段，具有高特異性、高親和力、易于化學(xué)合成和修飾、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，是比抗體更為有潛力的靶標(biāo)識(shí)別元素，因此常被廣泛應(yīng)用于元素識(shí)別的生物傳感檢測體系中[6-7]。近年來，通過熒光[8-9]、化學(xué)發(fā)光[10]、電化學(xué)[11]、表面等離子體共振[12]和比色[13]等方法構(gòu)建了許多基于適配體的生物傳感器。其中比色法因其檢測時(shí)間短、成本較低、不需要復(fù)雜的操作技術(shù)等而得到了廣泛的應(yīng)用。膠體金(AuNPs)由于其高消光系數(shù)和表面等離子體共振現(xiàn)象(SPR)而被用于比色體系中。例如，應(yīng)用無標(biāo)記適配體和免修飾AuNPs的比色法檢測蛋白質(zhì)[14]、金屬離子[15]和小分子[6]等。Jia等[16]使用了具有38-寡聚體序列的MG-RNA適配體，研究發(fā)現(xiàn)，MG-RNA適配體可以剪裁成27個(gè)堿基序列(5’-GGAUCCCGACUGGCGAGAGCCAGGUAACGAAUG-GAUCC-3’)[17]，與38序列具有相同的識(shí)別性能，本研究使用具有27個(gè)堿基序列的MG-RNA核酸適配體。

基于免修飾AuNPs和無標(biāo)記RNA建立可視化檢測MG的方法。MG的特異性RNA適配體可保護(hù)AuNPs免受鹽誘導(dǎo)的聚集作用，使AuNPs呈分散狀態(tài)而顯紅色。當(dāng)有MG存在時(shí)，RNA與MG特異結(jié)合，導(dǎo)致AuNPs失去保護(hù)而聚集，肉眼可觀察到溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色。通過可見光度法可檢測出溶液在520和690 nm處吸光度值的變化。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，選擇性強(qiáng)，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣中微量MG的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和試劑

孔雀石綠(MG，天津福晨化學(xué)試劑廠)；氯金酸(HAuCl4，上海阿拉丁試劑有限公司)；焦碳酸二乙酯(DEPC，上海阿拉丁試劑有限公司)；氯化鈉、醋酸鈉(上海國藥化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(廣東錫龍科技有限公司)；MG核酸適體(上海生工生物技術(shù)有限公司)。96孔板(廈門科展)。表1為本實(shí)驗(yàn)中所用RNA適配體序列，RNA用水溶解后在零下20 ℃儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)中所用到的水均為DEPC水(1‰ DEPC高溫高壓處理)，所有材料包括離心管、槍頭等均用1‰ DEPC浸泡過夜后再高壓處理烘干后方使用。

圖1 不同條件下膠體金TEM圖(a): AuNPs; (b): AuNPs, RNA, NaCl混合溶液; (c): 5 μmol·L-1 MG與AuNPs, RNA, NaCl混合溶液;(d): 不同條件下AuNPs的吸收光譜圖

1.2 儀器

紫外-可見吸收光譜的檢測使用美國硅谷公司的Molecular Devices酶標(biāo)儀；AuNPs的制備使用北京龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司的MS7-H550-PRO磁力攪拌器；AuNPs的電鏡表征使用日本電子光學(xué)實(shí)驗(yàn)室的JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)。TEM表征所用樣品的制備使用德國Christ公司的Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)；RNA使用前離心處理采用德國Eppendorf的5417R高速冷凍離心機(jī)。

2.3 AuNPs的合成

AuNPs合成方法參考文獻(xiàn)[18]的方法并稍作修改。首先，將10 mL 38.8 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液快速加入沸騰的HAuCl4(100 mL，1 mmol·L-1)溶液中。溶液由黃色變?yōu)榫萍t色后，繼續(xù)加熱攪拌20 min，待溶液冷卻至室溫后于4 ℃保存?zhèn)溆?。制得的AuNPs的濃度約為14 nmol·L-1，其消光系數(shù)為2.01×108mol-1·cm-1，直徑約為13 nm，吸收峰在520 nm處[19]。

2.4 MG檢測

用醋酸鈉緩沖液(pH 6.5)配制不同濃度的MG溶液。將30 μL 10 μmol·L-1的RNA適配體的與50 μL的MG溶液混合于96孔板中，充分振蕩10 min。然后加入70 μL 7 nmol·L-1的AuNPs溶液，反應(yīng)5 min后，加入50 μL 0.2 mol·L-1的NaCl溶液，振蕩20 min后用酶標(biāo)儀掃描450～750 nm波長下吸收光譜圖，根據(jù)吸光度計(jì)算MG溶液的濃度。所有實(shí)驗(yàn)操作均在室溫下進(jìn)行。

2.5 加標(biāo)回收及HPLC操作條件

水樣取自當(dāng)?shù)厥袌龅酿B(yǎng)殖水。將水樣用尼龍膜過濾，分別取1 mL加入不同濃度MG (1.2，2.5和5.0 μmol·L-1)。從中取50 μL加入到檢測體系中，分別測定520和690 nm處的吸光度值。用HPLC驗(yàn)證MG檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，HPLC操作條件為：色譜柱采用了C18柱(100 mm×4.6 mm, 3.6 μm)，流動(dòng)相為乙酸銨溶液(50 mmol·L-1, pH 4.5)和乙腈等度洗脫(40∶60,V/V)流速為0.5 mL·min-1, 檢測波長為618 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

圖1(a, b, c)為不同條件下膠體金溶液的透射電子顯微鏡(TEM)圖，圖1(d)為不同條件下溶液的吸收光譜圖。圖2的實(shí)驗(yàn)原理表明：在AuNPs溶液中加入NaCl，由于檸檬酸負(fù)電荷的中和作用使得AuNPs發(fā)生聚集[15]，溶液的顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，可見吸收峰從520 nm移到690 nm處。當(dāng)在該溶液中加入RNA適配體時(shí)，RNA適配體與AuNPs通過靜電結(jié)合，同時(shí)溶液中的NaCl還可以穩(wěn)定RNA鏈的結(jié)構(gòu)、減小鏈之間以及AuNPs之間的斥力，使RNA更容易吸附到AuNPs上，保護(hù)AuNPs不發(fā)生聚集[20]。然而，當(dāng)有MG存在時(shí)，由于MG與RNA適配體結(jié)合具有特異性，而RNA適配體與AuNPs表面的靜電作用較弱，MG與RNA適配體優(yōu)先結(jié)合，游離的AuNPs失去RNA適配體的保護(hù)作用遇鹽發(fā)生聚集。肉眼可以觀察到溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。此時(shí)，用酶標(biāo)儀測出溶液在520 nm處的吸光度值有所降低，690 nm處的吸光度值有所增加。在此基礎(chǔ)上，建立了一種基于核酸適配體檢測MG的可視化檢測方法。

圖2 實(shí)驗(yàn)原理圖

圖3 分別在不同NaCl(a), RNA(b)和AuNPs(c)濃度下溶液中有或無MG(12.5 μmol·L-1)時(shí)吸光度比值的變化Δ(A690/A520)

Fig.3Δ(A690/A520)atdifferentconcentrationsofNaCl(a),RNA(b)andAuNPs(c);TheconcentrationofMGwas12.5μmol·L-1

2.2 條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)以體系中添加與不添加MG時(shí)，溶液在690 nm處與520 nm處吸光度比值的差值Δ(A690/A520)為檢測信號(hào)，對NaCl濃度、RNA適配體濃度和AuNPs的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，如圖3所示。結(jié)果顯示，NaCl最佳濃度為0.2 mol·L-1，RNA最佳濃度為10 μmol·L-1，AuNPs最佳濃度為7 nmol·L-1。

2.3 MG分析性能

在最優(yōu)條件下，用一系列濃度的MG建立工作曲線。如圖4(b)所示，在0.6～12.5 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，Δ(A690/A520)與MG呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.06X-0.01 (R2=0.993)。用3α/κ(α為9次檢測MG標(biāo)準(zhǔn)偏差，κ為線性回歸方程的斜率)計(jì)算該方法的檢出限為為0.04 μmol·L-1。如圖4(a)所示，檢測體系顏色由紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)色。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)在1 h內(nèi)完成，優(yōu)于以前報(bào)道的MG檢測方法，表1為幾種MG檢測方法的比較結(jié)果。

圖4 不同MG濃度下(0～12.5 μmol·L-1)反應(yīng)體系吸收光譜曲線(a)；不同濃度MG與Δ(A690/A520)值的線性關(guān)系以及顏色變化圖(b)

Fig.4(a)TheabsorbancespectraofAuNPsinthepresenceofdifferentconcentrationsofMG(0～12.5μmol·M-1); (b)ThelinearrelationshipbetweenthevaluesofΔ(A690/A520)andtheconcentrationsofMG(R2=0.993).Insetshowsthecorrespondingcolorchanges

表1 不同MG檢測方法的比較Table 1 Comparison of different methods for MG detection

2.4 選擇性

選擇水產(chǎn)養(yǎng)殖的其他幾種禁用殺菌藥物鹽酸土霉素(OTH)、磺胺(SAs)、氯霉素(CAP)和隱性孔雀綠(LMG)研究本體系的選擇性。結(jié)果如圖5所示，加入MG的體系A(chǔ)690/A520值明顯高于其他四種藥物。MG體系的顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，而其他顏色不變。結(jié)果表明，該比色分析法對MG的檢測具有較高的特異性。

圖5 MG檢測的選擇性試驗(yàn)

MG和其他幾種藥物的濃度皆為2.5 μmol·L-1

Fig.5SpecificityoftheassayforthedetectionofMG

The concentrations of MG and other drugs were 2.5 μmol·L-1

2.5 養(yǎng)殖水樣中MG的檢測

將該比色法應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣中MG的檢測。結(jié)果如表2所示，MG回收率為92%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.23%～1.77%。為驗(yàn)證所建立的方法的可靠性和準(zhǔn)確性，采用高效液相色譜法(HPLC)對加標(biāo)水樣進(jìn)行了驗(yàn)證，表2中的數(shù)據(jù)表明，HPLC與所建立的核酸適配體/AuNP生物傳感器方法的檢測結(jié)果一致，表明所建立的方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣中的MG。

3 結(jié) 論

建立了一種基于MG-RNA適配體和膠體金(AuNPs)的高靈敏可視化檢測方法，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，這是一種基于可視化或比色檢測MG的生物傳感檢測方法；其次，該方法不需要對檢測材料進(jìn)行任何的化學(xué)修飾，從而簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，并降低了檢測成本；第三，以RNA作為MG的特異識(shí)別核酸適配體，提高了檢測的特異性。因此，該方法可用于檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的微量MG含量。

表2 RNA/AuNPs檢測體系中MG水樣加標(biāo)回收率和HPLC檢測結(jié)果Table 2 Recovery tests of MG in aquaculture water measured with aptamer/AuNP biosensor and HPLC, respectively

*：以測定值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表述