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        陽離子鋁酞菁-血卟啉單甲醚締合物熒光探針對(duì)黃連素的特異性響應(yīng)及其應(yīng)用

        2020-03-20 10:18:32鄧雅斌薛茂強(qiáng)李東輝
        光譜學(xué)與光譜分析 2020年3期
        關(guān)鍵詞:酞菁黃連素小檗

        鄭 霄,周 濤,張 艷,鄧雅斌,黃 萍,薛茂強(qiáng),李東輝*

        1. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心,福建 廈門 361102 2. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,福建 廈門 361102

        引 言

        黃連素(Berberine,BBR)又名小檗堿,是一種可從黃連、黃柏等植物中提取的活性生物堿。其藥理作用廣泛,不僅可抑制多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌治療感染性腹瀉[1]、調(diào)節(jié)糖代謝和脂質(zhì)代謝治療Ⅱ型糖尿病[2]、改善膽固醇代謝治療高血脂[3],還對(duì)炎癥[4-5]、心律失常[6-7]、阿爾茲海默病[8]和腫瘤[9-11]等均具有治療作用。為更好地評(píng)價(jià)黃連素從而改善其臨床應(yīng)用,建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的定量分析方法具有很重要的實(shí)際意義。

        目前黃連素檢測(cè)方法有高效液相色譜法[12-14]、紫外分光光度法[15-16]、電極法[17]、熒光量子點(diǎn)分析方法[18],但這些方法需要較復(fù)雜的樣品前處理,操作繁瑣,對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。

        四-三甲基氨基鋁酞菁是一種新型的紅區(qū)發(fā)射熒光化合物,具有熒光量子產(chǎn)率高、檢測(cè)靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。特別是與傳統(tǒng)熒光探針相比,陽離子鋁酞菁[Tetra(trimethylammionio) aluminum phthalocyanine,TTMAAlPc]的發(fā)射波長(zhǎng)在長(zhǎng)波區(qū)域(其發(fā)射峰在670 nm左右),因此可有效避開散射光和背景熒光的干擾。而且,該化合物可在長(zhǎng)波段進(jìn)行激發(fā),具有很強(qiáng)的抗光漂白能力。上述特點(diǎn)使TTMAAlPc具有巨大的實(shí)際應(yīng)用潛力,近年來,TTMAAlPc在分析科學(xué)特別是生物分析化學(xué)中的應(yīng)用已引起了人們的興趣和關(guān)注[19-20]。

        本研究發(fā)現(xiàn),血卟啉單甲醚(hematopophyrin monomethyl ether,HMME)對(duì)TTMAAlPc具有高效熒光猝滅作用,形成近乎無熒光的締合物,而該締合體系體系中存在黃連素時(shí),TTMAAlPc的熒光顯著恢復(fù)。據(jù)此,以TTMAAlPc和HMME構(gòu)建了離子締合物紅區(qū)熒光探針(TTMAAlPc-HMME),應(yīng)用于鹽酸小檗堿的測(cè)定,取得了滿意的結(jié)果,開拓了元素酞菁熒光化合物的新應(yīng)用。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器

        LS-55型熒光分光光度計(jì)(PerkinElmer,美國(guó)),檢測(cè)器為R928紅敏光電倍增管,帶恒溫附件;Evolution 220分光光度計(jì)(Thermo,美國(guó));Orion Star A211 pH Meter(Thermo scientific,美國(guó));DC-3006低溫恒溫槽(寧波新芝生物科技股份有限公司);精密天平(Sartorius公司,德國(guó));OMNI實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)(銳思捷科學(xué)儀器有限公司);1 cm石英熒光比色皿。

        1.2 試劑

        陽離子鋁酞菁(TTMAAlPc),據(jù)文獻(xiàn)[21]合成并純化。TTMAAlPc儲(chǔ)備液濃度為1.0×10-2mol·L-1,4 ℃避光保存,工作液濃度為1.0×10-3mol·L-1;血卟啉單甲醚注射液(第二軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)研究所),20 mg·mL-1,4 ℃避光保存;鹽酸小檗堿(美國(guó)Sigma公司);復(fù)方黃連素片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司)。

        磷酸廣范緩沖液(由0.1 mol·L-1鹽酸、1/15 mol·L-1磷酸二氫鉀、1/15 mol·L-1磷酸氫二鈉、1/15 mol·L-1磷酸鈉配制而成),Britton-Robinson緩沖液(將0.04 mol·L-1的磷酸、乙酸和硼酸三酸混合液與0.2 mol·L-1NaOH溶液按一定比例混合配制),硼砂緩沖液(以硼砂NaB4O7·10H2O和NaOH混合配制),Tris-鹽酸緩沖液,巴比妥-鹽酸緩沖液,甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液,硼酸-氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液,二乙醇胺-鹽酸緩沖液,氨-氯化銨緩沖液。

        所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

        1.3 方法

        于4.0 mL塑料離心管中依次加入高純水、12 μL TTMAAlPc(10-3mol·L-1)、300 μL pH 9.00的磷酸廣范緩沖液和24 μL HMME(1 mg·mL-1),混勻靜置10 min后,加入一定濃度的鹽酸小檗堿,反應(yīng)體系的總體積為3.0 mL,渦旋震蕩混勻,反應(yīng)40 min后檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度,激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)為610和670 nm,狹縫均為5.0 nm。未加鹽酸小檗堿的溶液熒光強(qiáng)度記為If0,加鹽酸小檗堿的熒光強(qiáng)度記為If,前后體系熒光強(qiáng)度的變化記為ΔIf(ΔIf=If-If0),體系熒光猝滅倍數(shù)記為n(n=If0/If)。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 TTMAALPc的分子結(jié)構(gòu)與光譜特性

        陽離子鋁酞菁(TTMAAlPc,圖1)是一種具有類似卟啉結(jié)構(gòu)、中心配位原子為三價(jià)鋁離子的紅區(qū)熒光化合物。母體結(jié)構(gòu)的四個(gè)苯環(huán)上各連接一個(gè)三甲基取代的季銨基團(tuán),故其結(jié)構(gòu)富含正電荷,因而易溶于水,十分有利于水相中的應(yīng)用。TTMAAlPc的量子產(chǎn)率高且在較大pH范圍中保持穩(wěn)定;而且,TTMAAlPc是一種紅色熒光探針,匹配以合適的檢測(cè)器(紅敏光電倍增管),可顯著提高檢測(cè)靈敏度;另外,由于其長(zhǎng)波發(fā)射的特點(diǎn),能有效避開背景熒光和散射光的干擾,在實(shí)際應(yīng)用中具有優(yōu)勢(shì)。

        圖1 陽離子鋁酞菁的分子結(jié)構(gòu)

        2.2 反應(yīng)體系的光譜行為和機(jī)理探討

        血卟啉單甲醚(HMME,圖2)是一種母體具有大平面結(jié)構(gòu)的卟啉衍生物,通過甲氧基取代血卟啉側(cè)鏈上的一個(gè)羥基而得。研究發(fā)現(xiàn)在堿性介質(zhì)中,于TTMAAlPc溶液中加入適量HMME后,TTMAAlPc熒光被高效猝滅(圖3),反應(yīng)體系只發(fā)出微弱的熒光乃至不發(fā)熒光。分析認(rèn)為,這一現(xiàn)象的發(fā)生首先是因?yàn)檠策鴨渭酌雅c陽離子鋁酞菁分子都具有大平面、大π鍵的剛性結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)使二者易于通過平面疏水作用、π鍵重疊效應(yīng)而發(fā)生締合作用;其次,在反應(yīng)的介質(zhì)酸度下,TTMAAlPc帶正電而HMME帶負(fù)電,二者發(fā)生靜電相互作用;另外由于二者均富含強(qiáng)電負(fù)性的氧原子或氮原子,易于通過水分子介導(dǎo)的氫鍵作用進(jìn)一步發(fā)生締合。上述三種作用獨(dú)立觀之分別為弱相互作用,但多種作用力的疊加則可形成較強(qiáng)的超分子作用,促使TTMAAlPc與HMME之間形成穩(wěn)定的締合物TTMAAlPc-HMME。締合物中的TTMAAlPc受激后發(fā)生非輻射躍遷,故不發(fā)射熒光或只發(fā)射很弱的熒光。

        圖2 血卟啉單甲醚的分子結(jié)構(gòu)

        將黃連素(BBR,圖4)加入到上述猝滅體系中,發(fā)現(xiàn)TTMAAlPc的熒光顯著恢復(fù)。分析認(rèn)為,由于BBR具有較大平面共軛結(jié)構(gòu)且?guī)в姓姾杉岸鄠€(gè)具有較大電負(fù)性的氧原子,因而可與TTMAAlPc分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HMME,從而使締合物中的TTMAAlPc被釋放成為游離態(tài),導(dǎo)致體系的熒光恢復(fù),且恢復(fù)程度與加入黃連素的量呈線性正相關(guān)(圖5)。據(jù)此,本研究建立了靈敏度高、操作性強(qiáng)的黃連素?zé)晒舛糠治鲂路椒ā?/p>

        圖3 HMME對(duì)TTMAAlPc激發(fā)光譜(a,a’)和發(fā)射光譜(b,b’)的高效猝滅作用

        Fig.3High-efficiencyquenchingeffectontheexcitationandemissionoffluorescenceofTTMAAlPcintheabsence(a,a’)andpresence(b,b’)ofHMME

        x: Excitation spectra;x’: Emission spectra

        [TTMAAlPc]=2.0×10-6mol·L-1;[HMME]=6.0 μg·mL-1

        圖4 黃連素的分子結(jié)構(gòu)

        圖5 不同濃度黃連素對(duì)TTMAAlPc-HMME的熒光響應(yīng)行為

        Fig.5FluorescencebehaviorofTTMAAlPc-HMMEinthepresenceofvariousconcentrationsofBerberine

        [TTMAAlPc]=3.0×10-6mol·L-1(a,a’); [TTMAAlPc]=3.0×10-6mol·L-1, [HMME]=6.0 μg·mL-1(b,b’); [TTMAAlPc]=3.0×10-6mol·L-1, [HMME]=6.0 μg·mL-1,The concentrations of BBR were 1.26 mg·L-1(c,c’), 13.5 mg·L-1(d,d’), 23.1 mg·L-1(e,e’) and 43.5 mg·L-1(f,f’) , respectively;λex=610 nm,λem=670 nm; Slit-width for excitation and emission were both set at 5.0 nm

        2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

        2.3.1 pH的影響與緩沖介質(zhì)的篩選

        先以P-B廣范緩沖液為反應(yīng)介質(zhì),考察了不同pH值的HMME對(duì)TTMAAlPc的熒光猝滅行為??梢钥闯觯趐H 8.0~10.0的介質(zhì)中,HMME對(duì)TTMAAlPc的猝滅效果最好(圖6),故選擇在pH 9.0的介質(zhì)中進(jìn)行猝滅反應(yīng)。隨后考察了黃連素存在下9種pH 9.0的不同緩沖液對(duì)體系熒光恢復(fù)的影響,所用的緩沖液包括P-B、二乙醇胺-鹽酸、Tris-鹽酸、氨-氯化銨、硼砂、B-R、巴比妥-鹽酸、甘氨酸-氫氧化鈉和硼酸-鹽酸-氫氧化鈉緩沖液??梢钥闯觯琾H 9.0 P-B緩沖液的熒光強(qiáng)度改變量ΔIf最好(圖7),故選用其作為反應(yīng)介質(zhì)。

        圖6 pH對(duì)TTMAAlPc-HMME體系熒光猝滅的影響

        Fig.6EffectofpHonfluorescencequenchingoftheTTMAAlPc-HMMEreactionsystem

        [TTMAAlPc]=3.0×10-6mol·L-1, [HMME]=6.0 μg·mL-1

        圖7 不同的pH 9.0緩沖液對(duì)體系熒光恢復(fù)的影響

        Fig.7EffectoffluorescencerecoveryofTTMAAlPc-HMMEinthepresenceofBBRindifferentkindsofbuffers(pH9.0)

        [TTMAAlPc]=3.0×10-6mol·L-1; [HMME]=6.0 μg·mL-1;[BBR]=1.26 mg·L-1

        2.3.2 HMME用量的優(yōu)化

        考查了HMME用量對(duì)TTMAAlPc的熒光猝滅效果,隨著HMME濃度的增加,體系熒光顯著猝滅并且趨于穩(wěn)定(圖8)。HMME達(dá)到6.0 μg·mL-1時(shí),體系的熒光可猝滅到最低值,表示在該濃度下TTMAAlPc已與HMME締合完全,因此選擇HMME的濃度為6.0 μg·mL-1。

        圖8 HMME用量對(duì)TTMAAlPc熒光猝滅的影響

        Fig.8FluorescencequenchingeffectofdifferentconcentrationsofHMMEonTTMAAlPc

        [TTMAAlPc]=3.0×10-6mol·L-1

        2.3.3 反應(yīng)時(shí)間的影響

        加入猝滅劑(HMME)反應(yīng)10 min后,猝滅體系(TTMAAlPc-HMME)即達(dá)到穩(wěn)定(圖9)。然后加入BBR,渦旋震蕩進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng),靜置20 min后體系熒光恢復(fù)并達(dá)到平衡,且至少在3 h內(nèi)保持穩(wěn)定(圖10)。因此,實(shí)際操作中采用熒光猝滅10 min后加入BBR,進(jìn)一步反應(yīng)20 min后進(jìn)行熒光檢測(cè)。

        圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光猝滅程度的影響

        2.3.4 反應(yīng)溫度的影響

        考察了不同反應(yīng)溫度下(0,25,50 ℃)對(duì)BBR工作曲線的影響(圖11)??梢钥闯?,反應(yīng)溫度對(duì)工作區(qū)間的線性和響應(yīng)區(qū)間有明顯的影響,25 ℃時(shí)線性關(guān)系最好。因此,實(shí)際操作采用常溫下進(jìn)行反應(yīng)、測(cè)定,既有利于獲得較好的線性關(guān)系和響應(yīng)區(qū)間又具有操作的簡(jiǎn)便性。

        圖10 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光恢復(fù)程度的影響

        Fig.10EffectofreactiontimeonthefluorescencerecoveryofTTMAAlPc-HMMEinthepresenceofBBR

        [TTMAAlPc]=3.0×10-6mol·L-1; [HMME]=6.0 μg·mL-1;[BBR]=13.5 mg·L-1

        Fig.11EffectofreactiontemperatureonthedeterminationofBBRusingTTMAAlPc-HMMEasafluorescentprobe

        [TTMAAlPc]=3.0×10-6mol·L-1, [HMME]=6.0 μg·mL-1

        2.3.5 TTMAAlPc用量的考察

        考察了TTMAAlPc的用量對(duì)黃連素測(cè)定工作曲線的影響??梢钥闯觯w系的熒光強(qiáng)度與黃連素的濃度在一定區(qū)間內(nèi)有良好的線性關(guān)系,結(jié)果表明TTMAAlPc濃度為3.0×10-6mol·L-1時(shí)線性范圍最寬,檢測(cè)限最低(表1),故最終選用TTMAAlPc濃度為3.0×10-6mol·L-1。

        表1 TTMAAlPc用量的優(yōu)化Table 1 Optimization of the TTMAAlPc usage

        圖12 黃連素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

        3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

        在最優(yōu)條件下,測(cè)定并制作黃連素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(圖12)。以黃連素的濃度(c,mg·L-1)為橫坐標(biāo),體系恢復(fù)前后的熒光變化量(ΔIf)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,得到的線性回歸方程為:ΔIf=12.85c+66.30,r=0.997 2,線性區(qū)間為0.3~69.0 mg·L-1,檢測(cè)限為15.0 μg·L-1。

        4 干擾物質(zhì)的考察

        對(duì)黃連素檢測(cè)常見共存或干擾物質(zhì)的影響進(jìn)行了考察(表2),結(jié)果表明在允許誤差((5%)內(nèi),常見的金屬離子、無機(jī)酸根離子、氨基酸、糖類對(duì)本法的測(cè)定基本無影響,某些表面活性劑和蛋白對(duì)本方法測(cè)定稍有影響,但都在允許的誤差范圍內(nèi)。

        表2 干擾物的考察Table 2 Tolerance of foreign substance

        注:表中帶“*”的共存物質(zhì)濃度單位為“mg·mL-1”

        5 樣品檢測(cè)

        將本法應(yīng)用于藥片中小檗堿含量的測(cè)定,并與文獻(xiàn)報(bào)道的分光光度法[16]進(jìn)行比較(表3)。樣品處理方法參照文獻(xiàn)[16]:取鹽酸小檗堿片10片,如為糖衣片,則除去糖衣后,精密稱定、研細(xì),精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸小檗堿30 mg),置100 mL量瓶中,加水適量,超聲溶解后加水至刻度,搖勻、濾過、棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液4.0 mL于另一100 mL量瓶中,加水至刻度,搖勻。兩種方法的檢測(cè)結(jié)果基本一致,但紫外分光光度法的線性范圍小于本法。

        表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Analytical results of actual samples

        6 結(jié) 論

        利用血卟啉單甲醚對(duì)紅區(qū)熒光化合物陽離子鋁酞菁的熒光高效猝滅作用,構(gòu)建以結(jié)構(gòu)匹配的TMMAAlPc和HMME組成的締合物為紅區(qū)熒光探針,通過理論上對(duì)藥物的結(jié)構(gòu)分析及實(shí)際的篩選實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可以使TTMAAlPc-HMME締合物探針的熒光顯著恢復(fù)。熒光響應(yīng)具有特異性和良好的線性關(guān)系,且對(duì)藥品中常見的金屬離子、糖類、蛋白等分子均具有較強(qiáng)的抗干擾能力。據(jù)此建立了操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、濃度范圍廣、具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的黃連素?zé)晒庠鰪?qiáng)定量分析新方法,開拓了酞菁紅色熒光探針在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用。

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