鄭 名，曹思敏，劉陽依，曹瀟丹，陳 壯，閆姝君，李昊陽，陳縉泉，徐建華

華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062

引 言

膽紅素(Bilirubin，BR)是一種黃色的線性四吡咯，是動物膽汁的主要色素[1]，可以直接從動物膽汁中提取。研究表明，BR能與金屬離子形成絡(luò)合物，且其絡(luò)合物的光譜性質(zhì)與BR本身存在顯著的差異。金屬離子對BR熒光性質(zhì)的影響可以分為三種不同的情況：大多數(shù)金屬離子，如Li+，Ba2+，Mn2+，F(xiàn)e3+，Co2+，Ni2+，Pb2+，La3+，Ce3+和Zr4+等，對BR的熒光性質(zhì)無明顯影響；一些金屬離子，如Cu2+和Hg2+，對BR有著顯著的熒光淬滅作用；而鋅離子Zn2+和Cd2+則對BR有著顯著的熒光增強(qiáng)作用[2]，并且BR對Zn2+有著較好的選擇性。

Zn2+在生命及生產(chǎn)活動中具有重要作用[3-4]，因此對Zn2+的檢測目前已成為最受關(guān)注的研究之一?？焖?、高效、準(zhǔn)確地檢測存在于人體和生活環(huán)境中的Zn2+，對保障人類健康，以及醫(yī)學(xué)和植物學(xué)應(yīng)用上具有重要的應(yīng)用價值。由于Zn2+具有穩(wěn)定的3d10電子構(gòu)型[5]，傳統(tǒng)地檢測方法例如：原子吸收光譜法(AAS)[6]、滴定法[7]、電化學(xué)法[8]等并不適用于高效檢測Zn2+。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用分子熒光探針技術(shù)檢測Zn2+已經(jīng)獲得大量成果。這些探針分子主要包括喹啉衍生物[9]、熒光素[10]、香豆素衍生物[11]等，它們具有高選擇性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[12]，但是，這些探針的分子量一般較大，且合成步驟多。BR作為熒光分子探針無需繁雜的合成步驟，本文在Zn2+對BR的熒光增強(qiáng)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，通過分析Zn2+與BR混合后的紫外-可見光吸收和穩(wěn)態(tài)熒光光譜特征，結(jié)合雙波長熒光比值法，構(gòu)建了BR作為Zn2+熒光探針的檢測方法。其中，作者首次采用BR在波長663和600 nm處穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度比值的方法系統(tǒng)地研究了BR與鋅離子濃度在0～90 μmol·L-1范圍內(nèi)變化的關(guān)系。該方法與常用的單波長熒光強(qiáng)度探測方法比較，有效地避免了探針BR濃度變化及激發(fā)光強(qiáng)度變化等非目標(biāo)因素的影響，能夠?qū)崿F(xiàn)更準(zhǔn)確地對Zn2+進(jìn)行檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

穩(wěn)態(tài)吸收光譜數(shù)據(jù)的采集是使用紫外可見分光光度計(TU1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。儀器可在190～900 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行探測，波長準(zhǔn)確度±0.3 nm。

穩(wěn)態(tài)熒光光譜采用的是Horiba公司生產(chǎn)的FluoroMax-4型熒光光譜儀。因?yàn)椴煌牟ㄩL光源的發(fā)射功率不一樣，且探測器在不同波長下的探測效率也不一樣，所以我們在檢測樣品的穩(wěn)態(tài)熒光光譜時選用S1c/R1c。

本研究所使用的所有化學(xué)試劑，均來源于商業(yè)購買，且未經(jīng)過任何的提純處理。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，光譜級，>99.9% GC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；BR，B4126-1G，≥98%(EmM/453=60)，powder，西格瑪奧德里奇中國；無水乙酸鋅，99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

用BR粉末和無水乙酸鋅粉末分別配制2 mmol·L-1的BR儲備液與2 mmol·L-1的Zn2+儲備液，溶劑均為DMSO。準(zhǔn)確量取BR溶液于不同的離心管中，分別在每一個不同的離心管中依次滴加梯度濃度的Zn2+溶液，混合均勻后，使得探針BR在離心管中的最終濃度為10 μmol·L-1，Zn2+與探針BR的摩爾比為1～9倍。

將每個離心管中的混合樣品分別移取至各個石英比色皿中，使用紫外可見分光光度計，以空氣為參比，進(jìn)行穩(wěn)態(tài)吸收光譜數(shù)據(jù)的采集；采用穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀，分別測量樣品的穩(wěn)態(tài)熒光光譜，激發(fā)波長為355 nm，狹縫寬度設(shè)為3 nm/ 3nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 Zn2+對BR的紫外-可見吸收光譜特性的影響

室溫下，BR(10 μmol·L-1)在DMSO溶液中隨著Zn2+濃度增加的紫外-可見吸收變化曲線如圖1所示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，探針BR在455 nm處有一個吸收峰，隨著Zn2+濃度的升高，在455 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸減弱，而在525 nm出現(xiàn)新的吸收峰，并且其強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，證實(shí)探針BR與Zn2+不斷結(jié)合，形成了新的金屬配合物[13]。在355和475 nm處明顯的等吸收點(diǎn)也充分證明了探針BR與Zn2+已經(jīng)形成穩(wěn)定的配合物。

圖1 BR(10 μmol·L-1)隨Zn2+(0～90 μmol·L-1)濃度增加的紫外-可見吸收光譜變化圖

Fig.1UV-VisibleabsorbancespectraofBR(10μmol·L-1)inthepresenceofanincreasingZn2+concentration(0～90μmol·L-1)

2.2 Zn2+對BR的穩(wěn)態(tài)熒光光譜特性的影響

室溫下，將BR的濃度控制為10 μmol·L-1，向其中逐漸加入Zn2+，從BR的熒光發(fā)射光譜圖(圖2)中可以看出，當(dāng)激發(fā)波長為355 nm時，探針BR本身在525 nm處的熒光強(qiáng)度較弱。隨著Zn2+濃度的逐漸增加(0～90 μmol·L-1)，525 nm處熒光強(qiáng)度逐漸減弱。在663 nm處產(chǎn)生新的發(fā)射峰，發(fā)射峰值波長紅移了138 nm，并且其強(qiáng)度隨著Zn2+的加入逐漸增強(qiáng)。探針BR熒光增強(qiáng)的可能原因是在光誘導(dǎo)下，探針BR與Zn2+之間發(fā)生了電荷轉(zhuǎn)移作用[14]。

圖2是探針BR的穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度隨著鋅離子濃度的變化關(guān)系，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)探針BR與Zn2+的混合物在600 nm處沒有吸收，如圖1所示，而且在600 nm處的熒光基底強(qiáng)度隨著加入的鋅離子濃度增加只是有微小的變化。因此，我們使用比率型熒光探測方法，選擇探針BR在發(fā)射波長663和600 nm處穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度比值I663 nm/I600 nm，其隨Zn2+濃度變化曲線圖如圖3所示。從圖中可以看出，在0～20 μmol·L-1范圍內(nèi)，I663 nm/I600 nm值隨Zn2+濃度變化逐漸增大，其線性相關(guān)系數(shù)為r=0.940 87。進(jìn)一步增加Zn2+濃度，其熒光強(qiáng)度比值趨于飽和不再有明顯變化，表明此時溶液中探針BR與Zn2+的結(jié)合達(dá)到了平衡狀態(tài)。另外，Zn2+的加入可以使探針BR的溶液顏色由黃色變?yōu)榉奂t色，用肉眼即可直接觀察識別過程，這種明顯的顏色和熒光強(qiáng)度的變化，表明BR對Zn2+有良好的識別作用，可以實(shí)現(xiàn)對Zn2+的可視化檢測。

圖2 BR(10 μmol·L-1)隨Zn2+(0～90 μmol·L-1)濃度增加的熒光發(fā)射光譜變化圖

Fig.2FluorescencespectraofBR(10μmol·L-1)inthepresenceofanincreasingZn2+concentration(0～90μmol·L-1)

圖3 BR(10 μmol·L-1)在663和600 nm處熒光強(qiáng)度比隨Zn2+(0～90 μmol·L-1)濃度變化圖

Fig.3Ratio(663nm/600nm)inthefluorescenceintensitiesofBR(10μmol·L-1)at663and600nminthepresenceofanincreasingZn2+concentration(0～90μmol·L-1)

2.3 探針BR對Zn2+的檢測限

如圖4和圖5所示，Zn2+在0～10 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，探針BR在發(fā)射波長663和600 nm處發(fā)射熒光強(qiáng)度比值I663 nm/I600 nm與Zn2+的濃度之間存在非常好的線性相關(guān)。圖5中的線性回歸方程y=0.829 23x+0.573 79，相關(guān)系數(shù)r=0.999 87，以10次空白樣品的發(fā)射熒光強(qiáng)度比值I663 nm/I600 nm作為標(biāo)準(zhǔn)差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)差計算[15]得到探針BR對Zn2+的檢測限為0.1 μmol·L-1。這表明BR可以用來定量檢測Zn2+濃度。

圖4 BR(10 μmol·L-1)熒光曲線對Zn2+濃度的響應(yīng)關(guān)系圖

圖5 BR在663和600 nm處的熒光強(qiáng)度與Zn2+濃度線性擬合圖

Fig.5LinearfitcurveofratioofBR(10μmol·L-1)fluorescenceintensitiesat663and600nmwithrespecttoZn2+concentration

3 結(jié) 論

我們發(fā)現(xiàn)在探針BR的DMSO溶液中加入Zn2+后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，最大熒光發(fā)射波長紅移了138 nm，從525 nm移動到663 nm。探針BR對Zn2+的檢測范圍0～10 μmol·L-1，檢測限達(dá)到0.1 μmol·L-1，探針BR用雙波長熒光比值法可以被用來檢測環(huán)境中的Zn2+濃度，即已知BR濃度便可測定出Zn2+濃度。同時，探針BR是動物體中的一種膽汁色素，沒有復(fù)雜的合成步驟，且其與Zn2+結(jié)合后的熒光發(fā)射峰位于生物組織的透明窗口[16]，因此其對生物活體成像也具有潛在的應(yīng)用前景。