鄭顯輝龔又明鄧廣海覃軍黃昌杰羅明超謝鳴坤高巍

（1.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥學部，廣東 廣州510120； 2.廣東省中醫(yī)藥學會中藥專業(yè)委員會，廣東 廣州510120； 3.廣州今典精方藥業(yè)有限公司，廣東 廣州510000； 4.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州510006）

乳腺癌作為嚴重威脅世界女性健康的殺手之一，占女性所患惡性腫瘤的13.7%，且發(fā)病率逐年攀升［1］。 雖然現(xiàn)代醫(yī)學對乳腺癌的診治工作取得了顯著進展，但耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，伴隨著乳腺癌復發(fā)、轉移則成為最大的醫(yī)學難題［2］。 目前乳腺癌的治療包括手術治療、內分泌治療、放、化療以及分子靶向治療［3］，臨床效果欠佳。 化療對人體有較大的損傷，因此現(xiàn)代科學將目光投向中藥、植物等天然產(chǎn)物及其提取物。 DNA 損傷是癌變過程中的關鍵步驟，而氧化應激是DNA 損傷的重要原因。 有研究表明，活性氧（ROS）能夠通過多種機制影響癌癥的發(fā)生發(fā)展［4］。 薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L．var． ma-yuen（Roman） Stapf 的干燥成熟種仁［5］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。 薏苡仁油是薏苡仁提取物，現(xiàn)代研究表明，它有利于腫瘤的治療，能夠降低癌癥患者的疼痛水平，顯著提高患者的生活質量，且沒有明顯的不良反應［6］。 炒薏苡仁是薏苡仁常見炮制品，有研究發(fā)現(xiàn)，薏苡仁經(jīng)過炒制后，抗腫瘤成分甘油三油酸酯的含量明顯增加［7-9］，脂肪油及亞油酸含量也發(fā)生變化［10］。 目前，關于炒薏苡仁及其提取物抗腫瘤作用研究未見報道，本研究采用炒薏苡仁油處理人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 細胞，觀察其對該細胞凋亡的影響，并通過對ROS 和相關基因表達的檢測來探討其可能的機制，為臨床中乳腺癌的治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

MCF-7 和ZR-75-1 細胞購買于中科院細胞庫；RPMI1640 及胎牛血清購買于美國Gibico 公司；二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）試劑均購買于美國Ameresco 公司；ROS、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、過氧化氫酶（CAT）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDKDA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 等試劑盒均購買于TaKaRa 公司；PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；Annexin V-FITC／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購買于江蘇凱基生物技術股份有限公司；Bax、Bcl-2 抗體購買于Cell Signaling Technology 公司。

炒薏苡仁（批號181109041）購于康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)院主任中藥師覃軍鑒定為禾本科植物薏苡的成熟種仁炒制品，炒薏苡仁油由本實驗室自行制備，提取物配成質量濃度為1 g／mL母液，用RPMI1640 完全培養(yǎng)基稀釋成需要的濃度直接作用于細胞，用0.22 μm 的微孔過濾膜過濾，備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1細胞置于含10%（φ）胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放入37 ℃、5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 ～4 d，待細胞生長至密度為80%～90%時，以0.25%的胰蛋白酶進行消化及傳代處理。

1.2.2 MTT 法檢測細胞活性分別取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 細胞，約1×104／孔接種于96 孔板，過夜貼壁后，對照組加入完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入含不同濃度的炒薏苡仁油的培養(yǎng)基，每組設置6 個復孔。 炒薏苡仁油的終質量濃度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg／mL 培養(yǎng)36 h及48 h 后，加入20 μL 5 mg／mL 的MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 的DMSO，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 處測量各孔的吸光度（A）。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡分別取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 細胞，約10×104／孔接種于6 孔板，過夜貼壁后，對照組加入完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入含不同濃度的炒薏苡仁油的培養(yǎng)基，炒薏苡仁油的終質量濃度為0、0.125、0.250、0.500 mg／mL 培養(yǎng)48 h 后，消化細胞，1 000 r／min 離心5 min，收集細胞，重懸后加入5 μL Annexin V 和PI 試劑避光條件染色15 min，在1 h內上機檢測。

1.2.4 RT-PCR 檢測CDK4、CyclinA、CyclinE、Bax、Bcl-2 的表達水平實驗分為對照組、3 個不同質量濃度炒薏苡仁油（0.125、0.250、0.500 mg／mL）處理組。 分別將對數(shù)生長期的MCF-7 和ZR-75-1 細胞按照每4×105／孔接種到6 孔板中，藥物處理48 h 后用Trizol 裂解細胞提取細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA 再使用熒光定量試劑盒加入相應的引物進行擴增，上機檢測。 內參為GAPDH，目的基因為CDK4、CyclinA、CyclinE、Bax、Bcl-2，引物序列見表1。

表1 引物序列和產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequence and product length

1.2.5 Western blot 檢測細胞凋亡蛋白的表達分別取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 細胞，約10×104／孔接種于6 孔板，過夜貼壁后，對照組加入完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入含不同濃度的炒薏苡仁油的培養(yǎng)基，炒薏苡仁油的終質量濃度為0、0.125、0.250、0.500 mg／mL 培養(yǎng)48 h 后，加入裂解液裂解細胞，刮下6 孔板細胞在冰上裂解30 min，14 000 r／min離心10 min，取上清，煮沸5 min 獲得變性蛋白。 蛋白經(jīng)過SDS-PAGE 膠分離后轉移至PVDF 膜上，5%BSA 封閉1.5 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，孵育一抗，4 ℃過夜。 過夜孵育后洗滌3次，孵育二抗1 h，洗滌，利用ECL 發(fā)光液曝光，獲得條帶。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測ROS 及其相關氧化應激水平按照“1.2.3”項下方法進行細胞種板和給藥處理，吸取細胞上清液，采用ELISA 試劑盒說明書進行處理，在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm 處測量各孔的吸光度。 以ROS、SOD、GPX、CAT 的含量為縱坐標，450 nm 處的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算各組樣品中的ROS、SOD、GPX、CAT 含量。

1.2.7 統(tǒng)計學處理應用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 炒薏苡仁油對細胞活性以及細胞凋亡的影響

將MCF-7 和ZR-75-1 細胞分別采用不同濃度炒薏苡仁油處理36 h 和48 h 后，采用MTT 法檢測細胞的存活率變化，結果見表2、表3。 與對照品比較，質量濃度為0.500 mg／mL、1.000 mg／mL 和2.000 mg／mL 炒薏苡仁油處理36 h 后，MCF-7 和ZR-75-1細胞的A 值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05 或P＜0.01）；處理48 h 后，不同濃度炒薏苡仁油組中MCF-7 和ZR-75-1 細胞的A 值差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05 或P＜0.01），且其測定值具有時間和濃度依賴性。 根據(jù)檢測結果，選用濃度為0.125、0.250 及0.500 mg／mL 炒薏苡仁油干預細胞48 h 進行后續(xù)研究。

表2 不同濃度炒薏苡仁油處理后MCF-7 細胞的A 值Table 2 A value of MCF-7 cells treated with fried coix seed oil of different concentrations（±s）

表2 不同濃度炒薏苡仁油處理后MCF-7 細胞的A 值Table 2 A value of MCF-7 cells treated with fried coix seed oil of different concentrations（±s）

與對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 ρ／（mg·mL-1） 36 h 48 h對照組 - 0.503±0.003 0.514±0.003 0.125 0.451±0.002 0.402±0.001?0.250 0.423±0.001 0.378±0.002?炒薏苡仁油 0.500 0.375±0.003? 0.322±0.003??1.000 0.328±0.003??0.298±0.005??2.000 0.271±0.005??0.252±0.004??

由MTT 結果可知炒薏苡仁油作用于細胞48 h后能夠不同程度地抑制細胞生長。 接著利用流式細胞儀檢測MCF-7 和ZR-75-1 細胞的凋亡情況，見圖1、圖2。 不同劑量（0、0.125、0.250、0.500 mg／mL）炒薏苡仁油處理MCF-7 細胞的凋亡率分別為（0.20±0.001）%、（1.16±0.01）%、（2.91±0.13）%、（5.43±0.02）%，處理ZR-75-1 細胞的凋亡率分別為（0.68±0.01）%、（5.21±0.07）%、（6.50±0.01）%、（12.80%±0.08）%，各藥物處理組與對照組相比，隨著給藥濃度的提高其凋亡率呈現(xiàn)上升趨勢。

表3 不同濃度炒薏苡仁油處理后ZR-75-1 細胞的A 值Table 1 A value of ZR-75-1 cells treated with fried coix seed oil of different concentrations（±s）

表3 不同濃度炒薏苡仁油處理后ZR-75-1 細胞的A 值Table 1 A value of ZR-75-1 cells treated with fried coix seed oil of different concentrations（±s）

與對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 ρ／（mg·mL-1） A490（36 h） A490（48 h）對照組 - 0.511±0.004 0.525±0.003 0.125 0.489±0.004 0.410±0.005?0.250 0.437±0.002 0.384±0.003?炒薏苡仁油 0.500 0.382±0.002? 0.316±0.002?1.000 0.321±0.001?? 0.286±0.005?2.000 0.265±0.001?? 0.240±0.001????

2.2 炒薏苡仁油對MCF-7 和ZR-75-1 細胞增殖相關基因表達的影響

結果見表4，表5。 與對照組比較，各組炒薏苡仁油均能顯著下調MCF-7 和ZR-75-1 細胞中的CDK4、CyclinA 和CyclinE 的mRNA 表達（P＜0.01 或P＜0.05），且其表達水平具有濃度依賴性。

圖1 炒薏苡仁油對MCF-7 細胞的影響Figure 1 Effect of fried coix seed oil on MCF-7 cells

圖2 炒薏苡仁油對ZR-75-1 細胞的影響Figure 2 Effect of fried coix seed oil on ZR-75-1 cells

表4 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 細胞中CDK4、CyclinA 和CyclinE 基因表達的影響Table 4 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of CDK4，Cyclin A and Cyclin E genes in MCF-7 cells（±s）

表4 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 細胞中CDK4、CyclinA 和CyclinE 基因表達的影響Table 4 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of CDK4，Cyclin A and Cyclin E genes in MCF-7 cells（±s）

與對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 ρ／（mg·mL-1） CDK4 mRNA CyclinA mRNA CyclinE mRNA對照組 - 1.031±0.269 1.015±0.174 1.075±0.404炒薏苡仁油 0.125 0.647±0.000? 0.739±0.032? 0.504±0.013?0.250 0.605±0.016? 0.650±0.129? 0.454±0.172?0.500 0.543±0.049? 0.543±0.014?? 0.392±0.127?

表5 不同濃度炒薏苡仁油對ZR-75-1 細胞CDK4、CyclinA 和CyclinE 基因表達的影響Table 5 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of CDK4，Cyclin A and Cyclin E genes in ZR-75-1 cells

2.3 炒薏苡仁油對MCF-7 和ZR-75-1 細胞凋亡相關基因表達的影響

結果見表6、表7、圖3、圖4。 與對照組比較，各組炒薏苡仁油均能顯著上調MCF-7 和ZR-75-1 細胞中的Bax的mRNA 和蛋白的表達（P＜0.01 或P＜0.05），下調Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表達（P＜0.01或P＜0.05），且其表達水平具有濃度依賴性。

表6 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 細胞Bax 和Bcl-2 表達的影響Table 6 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells（±s）

表6 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 細胞Bax 和Bcl-2 表達的影響Table 6 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells（±s）

與對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 ρ／（mg·mL-1） Bcl-2 mRNA Bax mRNA對照組 - 1.000±0.003 1.031±0.277炒薏苡仁油 0.125 0.617±0.228? 1.549±0.226?0.250 0.553±0.016?? 1.611±0.216?0.500 0.483±0.096?? 1.784±0.264?

圖3 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 細胞Bax 和Bcl-2 表達的影響Figure 3 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells

表7 不同濃度炒薏苡仁油對ZR-75-1 細胞Bax 和Bcl-2 表達的影響Table 7 The effects of the expression of Bax and Bcl-2 in ZR-75-1 cells by Fried coicis seed oil at different concentrations（±s）

表7 不同濃度炒薏苡仁油對ZR-75-1 細胞Bax 和Bcl-2 表達的影響Table 7 The effects of the expression of Bax and Bcl-2 in ZR-75-1 cells by Fried coicis seed oil at different concentrations（±s）

與對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 ρ／（mg·mL-1） Bcl-2 mRNA Bax mRNA對照組 - 1.000±0.003 1.031±0.277炒薏苡仁油 0.125 0.617±0.228? 1.549±0.226?0.250 0.553±0.016?? 1.611±0.216?0.500 0.483±0.096?? 1.784±0.264?

圖4 不同濃度炒薏苡仁油對ZR-75-1 細胞Bax 和Bcl-2 表達的影響Figure 4 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of Bax and Bcl-2 in ZR-75-1 cells

2.4 炒薏苡仁油對MCF-7 和ZR-75-1 細胞ROS 表達的影響

結果見表8。 與對照組比較，不同濃度的炒薏苡仁油能夠提高MCF-7 和ZR-75-1 細胞中的ROS濃度，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），且其測定值具有濃度依賴性。

2.5 炒薏苡仁油對MCF-7 細胞相關氧化應激指標的影響

結果見表9、表10。 與對照組比較，不同濃度的炒薏苡仁油能夠提高MCF-7 和ZR-75-1 細胞中的SOD、GPX 和CAT 濃度，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），且其測定值具有濃度依賴性。

表8 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 和ZR-75-1 細胞ROS表達的影響Table 8 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of ROS in MCF-7 and ZR-75-1 cells（±s）

表8 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 和ZR-75-1 細胞ROS表達的影響Table 8 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of ROS in MCF-7 and ZR-75-1 cells（±s）

與對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 ρ／（mg·mL-1） MCF-7 ZR-75-1對照組 - 7 427±117 5 862±67炒薏苡仁油 0.125 8 927±40? 6 927±40?0.250 9 760±51? 8 907±79??0.500 1 154±67?? 9 882±68??

表9 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 細胞SOD、GPX、CAT 表達的影響Table 9 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of SOD，GPX and CAT in MCF-7 cells（±s）

表9 不同濃度炒薏苡仁油對MCF-7 細胞SOD、GPX、CAT 表達的影響Table 9 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of SOD，GPX and CAT in MCF-7 cells（±s）

與對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 ρ／（mg·mL-1） SOD／（U·mL-1） GPX／U CAT／（U·mL-1）對照組 - 2.71±0.12 110.91±1.63 6.18±0.07炒薏苡仁油 0.125 3.40±0.14? 140.45±1.72? 7.26±0.09?0.250 3.76±0.19? 147.51±0.56? 7.80±0.36?0.500 4.17±0.12?? 155.02±1.82? 8.21±0.07?

表10 不同濃度炒薏苡仁油對ZR-75-1 細胞SOD、GPX、CAT 表達的影響Table 10 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of SOD，GPX and CAT in ZR-75-1 cells（±s）

表10 不同濃度炒薏苡仁油對ZR-75-1 細胞SOD、GPX、CAT 表達的影響Table 10 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of SOD，GPX and CAT in ZR-75-1 cells（±s）

與對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 ρ／（mg·mL-1） SOD／（U·mL-1） GPX／U CAT／（U·mL-1）對照組 - 1.82±0.02 105.20±4.77 4.22±0.09炒薏苡仁油 0.125 2.27±0.10 138.63±1.19? 5.43±0.08?0.250 2.62±0.09? 145.28±2.09? 5.64±0.06?0.500 2.73±0.04?? 150.62±1.11? 5.94±0.02?

3 討論

薏苡仁油是從薏苡仁中提取而得，主要由油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸等長碳鏈脂肪酸組成，不飽和脂肪酸含量較高，所含1，2-亞油酸-3-油酸三酰甘油、1，2-油酸-3-亞油酸三酰甘油、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸三酰甘油、甘油三油酸酯和1，2-油酸-3-棕櫚酸三酰甘油等5 種三酰甘油含量較高［11-12］。 研究表明，薏苡仁中甘油三油酸酯［13］、亞油酸及其異構化的共輒亞油酸［14］具有均抗腫瘤作用。 本文研究發(fā)現(xiàn)，炒薏苡仁油能夠抑制乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 細胞增殖，誘導其細胞凋亡，且其作用強度具有濃度依賴性。

有研究表明，薏苡仁油能夠抑制癌細胞周期干預細胞的增殖過程，從而導致細胞凋亡［15］。 CDK 參與細胞的增殖，能夠與Cyclin連接，CDK4 在細胞的G1 期被激活表達［16-17］。CDK4、CyclinA 和CyclinE過表達可引起細胞異常增殖和分化失去控制，引起腫瘤的發(fā)生。 本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)炒薏苡仁油干預后，細胞內CDK4、CyclinA 和CyclinE 基因表達量均明顯下調，提示炒薏苡仁油可通過調控周期相關基因CDK4、CyclinA 和CyclinE 的表達來抑制MCF-7 和ZR-75-1 細胞周期；Bcl-2 家族在調節(jié)線粒體介導的凋亡通路中發(fā)揮著重要的作用，目前已在該家族中鑒定出20 多個成員，包括Bax 等促凋亡蛋白和Bcl-2 等抗凋亡蛋白［18］，而Bcl-2／Bax可調控細胞凋亡并在乳腺癌治療中發(fā)揮重要作用［19］。 本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)炒薏苡仁油干預后，MCF-7 和ZR-75-1 細胞中Bcl-2 的mRNA 水平明顯降低，Bax的mRNA 水平明顯增高，提示炒薏苡仁油可通過下調Bcl-2，上調Bax基因的表達，誘導細胞凋亡。

ROS 參與了癌細胞中DNA 損傷的關鍵步驟，影響著癌癥的發(fā)生發(fā)展。 氧化應激及相關ROS 可修飾脂質、蛋白質、碳水化合物和核酸，誘導線粒體通透性的改變，從而誘導細胞凋亡［20］。 研究表明，乳腺癌組織ROS 含量較癌旁組織明顯升高，處于氧化應激狀態(tài)［21］，一般認為生理水平的ROS 是細胞正常活動所必需的，它參與許多細胞事件包括細胞增殖、糖轉運以及脂質合成等的調節(jié)。 但細胞內ROS生成超過一定的閾值，其可直接損傷細胞，誘導細胞死亡［22］。 本研究表明，經(jīng)炒薏苡仁油干預48 h 后，能促進MCF-7 和ZR-75-1 細胞ROS 水平表達，并且相關氧化應激指標SOD、GPX 和CAT 的水平也顯著上升，說明炒薏苡仁油可通過促進ROS 及其相關氧化應激指標的表達來促進細胞凋亡。

綜上所述，炒薏苡仁油對乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 細胞具有抑制作用，其作用機制可能是促進ROS 及其相關氧化應激指標SOD、GPX 和CAT 的釋放，并下調周期相關基因CDK4、CyclinA 和CyclinE的表達從而抑制細胞增殖，下調Bcl-2 和上調Bax基因的表達從而誘導細胞凋亡。 本研究僅對炒薏苡仁油抗乳腺癌的作用機制進行初探，如想進一步探討薏苡仁炮制前后抗癌作用，還需從兩者的化學成分、藥理藥效等方面進一步研究。