常 超 路普亮 趙艷芳*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院山東青島266109；2.青島中維安全檢測(cè)有限公司山東青島 266111)

在臨床診斷中準(zhǔn)確快速的測(cè)定血紅蛋白含量對(duì)于評(píng)估貧血程度及相關(guān)疾病至關(guān)重要。常用的血紅蛋白的檢測(cè)方法主要有熒光法[1-3]、比色法[4]、電化學(xué)法[5-7]等。然而這些方法中有的需要昂貴的試劑，有的探針制備方法復(fù)雜，有的需要進(jìn)行繁瑣的電極修飾，有的抗干擾能力差，故而開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、靈敏、成本低的血紅蛋白檢測(cè)方法具有實(shí)際意義。隨著納米材料制備技術(shù)的引入，熒光分析法得到了迅猛發(fā)展。量子點(diǎn)、碳納米點(diǎn)、熒光金屬納米簇、稀土摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料等新材料作為新型熒光探針，拓展了熒光分析法在食品、環(huán)境、生物檢測(cè)等方面的應(yīng)用[8-10]。熒光聚合物納米粒子(Fluorescent Organic Nanoparticles，F(xiàn)ONPs)因其具有穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，良好光穩(wěn)定性和生物安全性而引起人們的廣泛關(guān)注[11]。制備FONPs通常是以包埋、摻雜或共價(jià)鍵合的方式，將疏水性熒光有機(jī)染料結(jié)合進(jìn)聚合物納米粒子中，但這種制備方法往往存在染料泄露、合成步驟復(fù)雜、分散性差等不足[12]。

多巴胺(4-(2-氨基乙基)-1,2-苯二酚)可在堿性有氧條件下自聚合生成具有強(qiáng)粘附特性的聚多巴胺而被廣泛應(yīng)用于材料表面改性、催化、藥物輸送、傳感檢測(cè)等領(lǐng)域[13]。2012年，Zhang等[14]首次報(bào)道了用H2O2氧化聚多巴胺制備了熒光聚多巴胺納米粒子，該材料表現(xiàn)出良好的熒光性能、優(yōu)異的水溶性和生物相容性。自此，各種熒光聚多巴胺材料被廣泛報(bào)道[15-17]。多巴胺是多巴(3,4-二羥基-L-苯基丙氨酸)的脫羧產(chǎn)物，多巴有與多巴胺類似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，多巴亦可通過(guò)自聚反應(yīng)制得各種功能性材料[18]。然而，目前對(duì)于熒光聚多巴材料的研究還很少。我們?cè)鴪?bào)道[19]了采用一種在堿性乙醇條件下一步合成熒光聚多巴納米粒子的新方法，該方法無(wú)需高溫加熱及強(qiáng)氧化性試劑處理，所制備的聚多巴納米粒子表現(xiàn)出良好的熒光特性、單分散性及穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血紅蛋白可以靈敏的猝滅聚多巴納米粒子的熒光，基于血紅蛋白對(duì)聚多巴納米粒子熒光的猝滅現(xiàn)象發(fā)展了一種快速、靈敏的檢測(cè)血紅蛋白的熒光分析方法。與其它測(cè)定血紅蛋白的方法相比，發(fā)展的方法具有探針合成簡(jiǎn)便、成本低及線性范圍寬、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FL-4600熒光儀(日本，日立公司)；TU-1900雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度儀(北京普析通用公司)；KQ-400KT數(shù)控超聲儀(中國(guó)曙峰公司)；Milli-Q凈水器(美國(guó)，密理博公司)。

血紅蛋白(Hb)、人血清蛋白(HSA)、細(xì)胞色素c(Cyt c)、肌紅蛋白(Mb)購(gòu)自沃辛頓生化公司；多巴(L-Dopa)購(gòu)自阿拉丁公司；NaOH、NaHCO3、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、NaH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖(Glu)、抗壞血酸(Vc)、無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥公司。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 熒光聚多巴納米粒子的制備

參照文獻(xiàn)方法[19]制備熒光聚多巴納米粒子：準(zhǔn)確稱取10.0 mg多巴，10.0 mg NaOH加入到15 mL離心管中，隨后加入10 mL無(wú)水乙醇，常溫下超聲反應(yīng)1 h，將得到的溶液在高速離心機(jī)中分別以10 000、12 000 r/min離心兩次，每次15 min，除去顆粒較大的聚合物，將上清液冷凍干燥后，即得。

1.3 血紅蛋白的檢測(cè)

將聚多巴納米粒子分散于20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=3.0)中，配制成1.0 mg/mL的儲(chǔ)備溶液待用。在離心管中分別加入50 μL熒光聚多巴納米粒子分散液，20 μL不同濃度的血紅蛋白，以及930 μL PBS(pH=3.0,20 mmol/L)，混合均勻后避光反應(yīng)2 min，在310 nm激發(fā)波長(zhǎng)和490 nm發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光檢測(cè)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.4 實(shí)際樣品測(cè)定

將采集的10 μL指尖血樣用二次水稀釋至5 mL并孵育振蕩20 min，從而釋放出血紅蛋白。然后將該樣品溶液以3 000 r/min離心分離10 min，取10 μL的上清液加入940 μL PBS和50 μL聚多巴納米粒子溶液，按1.3節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚多巴納米粒子的性質(zhì)

分別將聚多巴納米粒子分散于酸性(pH=3.0)和堿性(pH=8.0)緩沖溶液中，在酸性條件下聚多巴粒子呈球形且分布均勻，尺寸在20～30 nm間，如圖1A所示。聚多巴納米粒子在酸性條件表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]。聚多巴粒子在堿性條件下穩(wěn)定性較差，并且熒光會(huì)隨著時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸降低，這可能是由于在堿性條件下聚多巴納米粒子間會(huì)繼續(xù)發(fā)生聚合反應(yīng)，尺寸持續(xù)增大并發(fā)生聚集現(xiàn)象而引起的(圖1B)。故后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，考察聚多巴納米粒子的光學(xué)特性及應(yīng)用時(shí)都是將其分散于PBS(pH=3.0)中進(jìn)行的。

圖1 熒光聚多巴納米粒子分散在pH=3.0(A)和pH=8.0(B)的磷酸鹽緩沖溶液中的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM images of ploy(DOPA) nanoparticles in phosphate buffer with different pH(A) pH=3.0;(B) pH=8.0.

由聚多巴納米粒子的紅外光譜(圖2A)可見(jiàn)，在3 600～3 100 cm-1處出現(xiàn)的寬峰為O-H和N-H 的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 630 cm-1與1 430 cm-1處出現(xiàn)的吸收帶則表明存在-COO-與-NH基團(tuán)，1 140 cm-1處為苯環(huán)上的C-O伸縮振動(dòng)吸收，860 cm-1為苯環(huán)上的C-H彎曲振動(dòng)吸收。聚多巴納米粒子的紫外-可見(jiàn)光譜和熒光發(fā)射光譜如圖2B所示。聚多巴納米粒子在280 nm和350 nm處有兩個(gè)紫外吸收峰。其熒光發(fā)射光譜范圍約為400～600 nm，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從300 nm變化到380 nm，其熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)的增加先增大后減小，在激發(fā)波長(zhǎng)為310 nm時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)最大發(fā)射波長(zhǎng)為490 nm。在可見(jiàn)光下聚多巴納米粒子溶液呈無(wú)色透明狀，而在365 nm波長(zhǎng)紫外燈下則發(fā)出明亮的綠色熒光(圖2B內(nèi)插圖)，表明所制備的聚多巴納米粒子具有良好的光致發(fā)光特性，并以硫酸奎寧為參比計(jì)算其熒光量子產(chǎn)率為23.2%。

圖2 (A)聚多巴納米粒子紅外光譜圖；(B)紫外-可見(jiàn)吸收(a)及熒光發(fā)射(b)光譜(內(nèi)插圖為聚多巴納米粒子在可見(jiàn)光(左)和紫外燈(右)下的照片)Fig.2 (A) Infrared spectrum of play(DOPA) nanoparticles;(B) UV-Vis absorption(a) and fluorescence emission(b) spectra of ploy(DOPA) nanoparticles(Insets show the photographs of prepared ploy(DOPA) nanoparticles under visible light(left) and 365 nm UV lamp light(right))

聚多巴納米粒子也表現(xiàn)出良好的抗光漂白性和鹽穩(wěn)定性。如圖3A所示，用氙燈連續(xù)照射熒光聚多巴納米粒子30 min后，材料的熒光強(qiáng)度僅有略微下降；在不同鹽濃度下材料的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化(圖3B)，表明聚多巴納米粒子有良好的鹽穩(wěn)定性，可適用于復(fù)雜的生物體系檢測(cè)；聚多巴納米粒子的熒光強(qiáng)度隨pH值的增大逐漸降低(圖3C)，當(dāng)pH=3.0時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)并且在此pH值及避光條件下聚多巴納米粒子的熒光強(qiáng)度在30 d內(nèi)無(wú)明顯變化。

圖3 聚多巴納米粒子的光穩(wěn)定性(A)、鹽穩(wěn)定性(B)和不同pH(C)下的熒光強(qiáng)度Fig.3 The stability of ploy(DOPA) nanoparticles during continuous excitation with a UV beam(A),in a salt medium(B) and fluorescence intensity changes at different pH values(C)

2.2 血紅蛋白檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分別采用磷酸鹽、檸檬酸鹽和乙酸鹽緩沖體系，在pH=3.0～6.0范圍內(nèi)考察了緩沖體系及pH對(duì)聚多巴納米粒子熒光猝滅效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH=3.0的磷酸鹽緩沖體系中的熒光猝滅效率達(dá)到最大值。體系中聚多巴納米粒子濃度(0.01～0.1 mg/mL)對(duì)熒光猝滅效率也存在影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著聚多巴納米粒子濃度的增大，猝滅效率逐漸增大，但當(dāng)聚多巴納米粒子濃度超過(guò)0.05 mg/mL時(shí)，猝滅效率反而下降，故選擇聚多巴納米粒子最佳濃度為0.05 mg/mL。實(shí)驗(yàn)又考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將探針與血紅蛋白溶液混合均勻后，2 min即可達(dá)到到穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度值，并且30 min內(nèi)熒光強(qiáng)度保持不變，這說(shuō)明基于聚多巴納米粒子的熒光探針具有快速響應(yīng)特征。如圖4A所示，聚多巴納米粒子的熒光隨著血紅蛋白濃度的增加逐漸降低，當(dāng)血紅蛋白濃度增加到650 mg/L時(shí)其熒光幾乎完全消失。血紅蛋白的吸收光譜與聚多巴納米粒子的激發(fā)和發(fā)射光譜均有部分重疊，可能是由于內(nèi)濾效應(yīng)的作用導(dǎo)致聚多巴納米粒子發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象[20]。在優(yōu)化條件下，血紅蛋白對(duì)聚多巴納米粒子的熒光猝滅效率(F0-F)/F0(F0、F分別為加入血紅蛋白前后聚多巴納米粒子的熒光強(qiáng)度)在0.065～5.9 mg/L和6.5～65 mg/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系(圖4B)，其線性方程分別為：Y=0.0026X+0.0446(R2=0.9961)和Y=0.0004X+0.3531(R2=0.9904)，檢出限(S/N=3)為0.0098 mg/L。

圖4 (A)血紅蛋白濃度對(duì)聚多巴納米粒子熒光發(fā)射光譜的影響；(B)不同濃度血紅蛋白與熒光強(qiáng)度線性擬合曲線Fig.4 (A)Fluorescence quenching of ploy(DOPA) nanoparticles upon addition of hemoglobin at different concentrations;(B) Linear fitting curve of the fluorescence intensity towards the concentration of hemoglobin

2.3 方法的選擇性

圖5 檢測(cè)血紅蛋白的選擇性Fig.5 Selectivity of the fluorescence quenching assay using ploy(DOPA) nanoparticles for hemoglobinConcentration of ploy(DOPA) nanoparticles is 0.05 mg/mL;concentration of each metal ion,Glu and Vc is 1 μmol/L,respectively;concentration of HAS,Cyt c and Mb is 3.3 mg/L、0.60 mg/L、0.84 mg/L,respectively.

雖已有眾多文獻(xiàn)采用不同的熒光納米材料實(shí)現(xiàn)了血紅蛋白的熒光測(cè)定(表1)，但文獻(xiàn)[1]和[20]中檸檬酸碳點(diǎn)、丙三醇碳點(diǎn)的合成需要長(zhǎng)時(shí)間高溫水熱反應(yīng)，而本文所使用的聚多巴納米粒子反應(yīng)條件溫和，無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備，無(wú)需高溫及強(qiáng)氧化試劑，后處理簡(jiǎn)單；與文獻(xiàn)[2]相比，聚多巴納米粒子合成步驟簡(jiǎn)便；與文獻(xiàn)[21]和[22]采用金納米點(diǎn)和金納米簇相比，聚多巴納米粒子成本低廉，易于推廣。此外本方法具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍，適用于血紅蛋白的快速測(cè)定。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

為了評(píng)價(jià)所構(gòu)建的熒光檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際血樣中血紅蛋白的檢測(cè)性能，對(duì)兩份志愿者的血樣進(jìn)行了檢測(cè)，并進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由表2可知，方法加標(biāo)回率在94.6%～106.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.67%。說(shuō)明本方法有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可用于實(shí)際血樣的測(cè)定。

表1 基于不同材料的熒光法檢測(cè)血紅蛋白的性能比較Table 1 Comparison of fluorescence methods for the determination of hemoglobin

表2 血樣中血紅蛋白的測(cè)定Table 2 Detection of hemoglobin in human blood samples

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)單的一步法在室溫下合成了性能優(yōu)異的熒光聚多巴納米粒子，并且將其用于血紅蛋白的快速測(cè)定，回收率和選擇性良好。該方法合成步驟簡(jiǎn)單、成本低廉、綠色環(huán)保，拓展了新型熒光聚多巴納米粒子在分析檢測(cè)中的應(yīng)用。