莊玉嬌 巫仙群 王宇蕊 文 勉 羅貴鈴 孫 偉 牛燕燕*

(海南師范大學化學與化工學院?？谑泄δ懿牧吓c光電化學重點實驗室海南?？?571158)

適配體(Aptamer)是經過指數富集配體系統(tǒng)進化的體外篩選技術而獲得的，具有特異性結合能力的DNA或RNA片段，基于其單鏈核酸結構和空間構象多樣性，能夠與特定的靶分子通過假堿基對的氫鍵、堆積、靜電作用等結合形成結構穩(wěn)定的三維結構，具有極強的識別能力和親和力[1-3]。光電化學生物分析技術是基于光照條件下，識別元件和目標分子間的生物識別作用引起的光電活性物質產生電信號變化的一種方法，可以實現待測物的定量檢測。該方法的激發(fā)信號和檢測信號的能量形式不同，傳感信號的背景值低于傳統(tǒng)電化學方法，因此具有較高的靈敏度和較低的檢測限[4-6]。

Hg2+是一種常見的重金屬污染物，多存在于土壤或者水體中且不能被降解，而且可以通過微生物的作用轉變?yōu)閯《镜募谆?，往往通過食物鏈富集并對人體健康產生極大危害，尤其對神經、腎臟等損傷較嚴重，可造成認知和行動障礙[7-10]。傳統(tǒng)的Hg2+檢測方法有原子吸收法、陽極溶出伏安法、等離子體質譜法等。雖然這些方法靈敏度高、特異性強，但是樣品前處理復雜，儀器價格昂貴且運行成本高，難以滿足快速實時檢測的需求。一些快速在線的檢測方法，如酶分析法、免疫分析法等，則無法對待檢測物準確定量，靈敏度和準確性也比較低[11]。為實現簡便快速的檢測目的，越來越多的研究開始關注如何提高定量分析的靈敏度和準確性。

本文以半導體納米TiO2為光電活性材料，以氧化銅錫(ITO)導電玻璃為基底電極，進一步修飾金納米星，通過Au-S鍵的共價結合，將巰基修飾的特異性適配體固定在其表面，以巰基乙酸做封閉劑，經過實驗參數的優(yōu)化，構建了一個光電化學分析的適配體傳感器，其光電化學反應原理如圖1所示。該傳感器用于檢測Hg2+時，適配體中的T堿基與其形成穩(wěn)定的“T-Hg2+-T”結構，導致傳感界面發(fā)生變化[12，13]，使傳感器特異性識別Hg2+前后光電流響應發(fā)生變化，從而實現Hg2+的快速定量分析。

圖1 適配體傳感器的制備及Hg2+檢測過程示意圖Fig.1 Illustration for aptamer sensor formation and Hg2+ detection process

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

PEAC 200A光電化學反應儀(天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司)，激發(fā)光波長為365 nm(LED光源)，偏置電壓為0.2 V。光電化學測試在IGS1130電化學工作站(廣州盈思儀器有限公司)上進行，采用三電極工作系統(tǒng)，以氧化銦錫(ITO，天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司)導電玻璃為基底電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為對電極。電解液為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.0)。JSM-7600F熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡、JSM-2010F透射電子顯微鏡(日本，JEOL公司)。

納米TiO2和Au納米星購自南京先豐納米材料科技有限公司。乙醇、丙酮、巰基乙酸(MPA)、磷酸鹽等均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。As3+、Mn2+、Al3+等金屬離子溶液均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。適配體(上海生工生物工程技術與服務有限公司)序列如下：5′-SH-(CH2)6-T T T T T T T T T T T-3′。適配體溶液由pH=7.0的PBS(0.01 mol/L)配制并保存于超低溫冰箱中待用。實驗過程中的用水由Milli-Q IQ7000超純水儀(默克密理博)制備。

1.2 Hg2+光電化學適配體傳感器的制備

ITO導電玻璃依次用丙酮、乙醇、水分別超聲清洗30 min，晾干后備用。在洗凈的ITO導電玻璃表面滴涂40 μL 2.0 mg/mL的納米TiO2分散液，置于70 ℃烘箱中烘30 min，將其標記為TiO2/ITO。再滴涂20 μL Au納米星分散液，室溫避光自然晾干，標記為Au/TiO2/ITO。進一步，滴涂20 μL 1.0 μmol/L的巰基修飾適配體溶液，常溫恒濕孵育2 h后，經0.01 mol/L PBS淋洗，再滴涂20 μL 0.1 mmol/L MPA，常溫恒濕孵育1 h，封閉電極表面未被核酸適配體覆蓋的空余位點，防止傳感器表面非特異性吸附。最后用0.01 mol/L PBS淋洗，室溫晾干后待用，標記為Aptamer/Au/TiO2/ITO。

圖2 (A)納米TiO2的掃描電鏡(SEM)圖；(B)金納米星的透射電鏡(TEM)圖Fig.2 (A) SEM image of TiO2 nanoparticles;(B) TEM image of Au nanostars

2 結果與討論

2.1 TiO2與Au納米星的表征

采用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對納米TiO2和Au納米星的形貌進行表征，結果如圖2所示。由圖可見，納米TiO2(圖2A)粒子呈分布均勻的短棒狀，平均粒徑約為250 nm。相同放大倍數的Au納米星(圖2B)呈尖角狀，平均粒徑約為20～50 nm。說明納米TiO2可以提供較大的比表面積并均勻負載Au納米星。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

為提高靈敏度，首先優(yōu)化了實驗條件?？疾炝瞬煌瑵舛萒iO2分散液(0.2～5.0 mg/mL)對TiO2/ITO修飾電極光電流響應的影響。如圖3A所示，當分散液濃度小于2.0 mg/mL時，隨著濃度的減小，光電流響應由于活性位點減少而減小；當分散液濃度等于2.0 mg/mL時，光電流響應達到最大；當分散液濃度大于2.0 mg/mL時，由于涂覆的TiO2層厚度增大，其本身的半導體性質反而阻礙了光生電子的傳遞，導致光電流響應逐漸減小。因此TiO2分散液最佳濃度為2.0 mg/mL。進一步考察了Au納米星用量對Au/TiO2/ITO修飾電極光電流響應的影響，如圖3B所示。當涂覆體積小于20 μL時，界面的光電性能隨著Au納米星負載量的增加而增強；當涂覆體積等于20 μL時，光電流達到最大；當涂覆體積大于20 μL時，過量的Au負載會覆蓋光電活性位點，導致光電流逐漸下降，故Au納米星最適宜的涂覆體積為20 μL。最后，考察了適配體的孵育濃度對Aptamer/Au/TiO2/ITO修飾電極光電性能的影響。如圖3C所示，當適配體濃度為1.0 μmol/L時，光電流響應最大，隨著適配體濃度逐漸增大，由于適配體本身的負電性，過量的適配體阻礙了電子的傳遞，光電流響應值逐漸減小。

圖3 不同濃度TiO2(a→g：0.2,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mg/mL)分散液(A)、不同體積Au納米星(a→g：5,10,15,20,25,30,35 μL)(B)和不同濃度適配體(a→f：0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μmol/L)(C)對Aptamer/Au/TiO2/ITO光電流響應的影響Fig.3 Effects of TiO2 concentration(a→g:0.2,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mg/mL)(A)，Au volume(a→g:5,10,15,20,25,30,35 μL)(B) and aptamer concentration (a→f:0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μmol/L)(C) on photocurrent

2.3 不同修飾電極的阻抗測定及分析

實驗對不同修飾的電極在光輻照條件下的交流阻抗進行分析。如圖4所示，ITO基底電極(曲線a)阻抗最大，阻抗值為40.0 Ω；當修飾TiO2納米材料(TiO2/ITO，曲線b)后阻抗顯著減小(24.9 Ω)。這是由于半導體材料在光輻照條件下產生光生電子，形成光電流，電阻減??；當修飾Au納米星(Au/TiO2/ITO，曲線c)后，阻抗略有減小(22.7 Ω)，具有高導電性的納米Au可以促進電子傳遞；當進一步孵育適配體(Aptamer/Au/TiO2/ITO，曲線d)后，阻抗增大(27.1 Ω)，修飾在電極表面帶負電的適配體阻礙了電子的轉移和傳遞。這與I-t曲線的表征結果是一致的，同時也說明每一步電極修飾的過程都是成功的。

2.4 Hg2+的檢測

當傳感界面(Aptamer/Au/TiO2/ITO)未結合Hg2+時，半導體納米TiO2吸收輻射光能，電子從價帶躍遷至導帶并流向外電路，而價帶的空穴接受界面電子供體的電子，形成光電流。當Hg2+與傳感界面的適配體特異性結合(Hg2+/Aptamer/Au/TiO2/ITO)時，界面結構會發(fā)生改變，導致光生電子傳遞路徑發(fā)生變化，光電流響應信號也隨之改變，這種變化趨勢與Hg2+濃度呈一定的函數關系。如圖5所示，隨著Hg2+濃度的增大，光電流響應信號逐漸減弱[14，15]，適配體富堿基T序列與Hg2+結合形成折疊的發(fā)卡結構，光生電子受Hg2+吸電子作用而流向汞，因此Hg2+在一定濃度范圍內，光電流響應隨著Hg2+濃度的增大而減小。實驗結果表明，當Hg2+濃度在1.0×10-9～5.0×10-7mol/L范圍時，光電流響應信號與Hg2+濃度呈較好的線性關系，線性方程為:I=-0.317logcHg2+-1.276，相關系數R2=99.7，檢測限(信噪比S/N=3)為3.1×10-10mol/L。

圖4 不同修飾電極的阻抗圖Fig.4 Electrochemical impedance spectroscopy of different modified electrodesa:ITO,b:TiO2/ITO,c:Au/TiO2/ITO,d:Aptamer/Au/TiO2/ITO) in the presence of 10.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4- and 0.1 mol/L KCl with the frequencies swept from 104 to 0.1 Hz.

圖5 不同Hg2+濃度(a→f：5.0×10-7,1.0×10-7,5.0×10-8,1.0×10-8,5.0×10-9,1.0×10-9 mol/L)下光電流響應信號(內嵌圖為I-logcHg2+的校正曲線)Fig.5 I-t curves of different concentration of Hg2+(a→f：5.0×10-7,1.0×10-7,5.0×10-8,1.0×10-8,5.0×10-9,1.0×10-9 mol/L)(Insert:calibration curve of I-logcHg2+)

2.5 特異性、穩(wěn)定性和重復性實驗

圖6A為該適配體傳感器的特異性測試結果。以金屬離子Mn2+、Ni2+、Al3+、Ag+、As3+、Cu2+、Pb2+和Cd2+(濃度均為1.0×10-7mol/L)為干擾離子，考察不同金屬離子與該傳感界面適配體作用后的光電流響應。在相同實驗條件下，所選擇的離子對傳感器檢測幾乎沒有影響，而Hg2+則產生顯著的光電流變化，說明該傳感器對Hg2+檢測具有良好的選擇性。圖6B為同一支適配體傳感器連續(xù)檢測10次的穩(wěn)定性測試結果，其光電流響應未發(fā)生明顯的變化，相對標準偏差(RSD)為4.01%。圖6C為相同實驗條件制備的7支適配體傳感器重復性測試，RSD為3.25%，說明其重復性好。

圖6 不同干擾離子的光電響應(A)、穩(wěn)定性能測試(B)和重復性能測試(C)Fig.6 Photocurrent change of the biosensor with different metal ions(A),stability test (B) and repeatability test(C)

2.6 實際樣品的檢測

采用標準加入法，進一步考察所制備的傳感器在實際環(huán)境樣品檢測中的應用。取實驗室自來水水樣，經微孔濾膜過濾后按本法測試，結果如表1所示，回收率范圍為95.0%～108.4%，說明該傳感器的檢測結果令人滿意。

表1 標準加入法測定水樣品中的Hg2+濃度Table 1 Recovery measurements of Hg2+ in water sample

3 結論

本文報道了一種基于納米TiO2和Au納米星的光電化學適配體傳感器特異性檢測Hg2+的方法。該方法以ITO導電玻璃為基底電極，以納米TiO2為光電活性物質，以Au納米星作為巰基修飾適配體共價結合的活性位點，通過Au-S共價鍵有效固定適配體，通過Hg2+與適配體的特異性結合來實現Hg2+定量檢測的目的，方法的檢測限為3.1×10-10mol/L。該傳感器制備方法簡單，且具有較強的特異性、良好的穩(wěn)定性和重復性，為Hg2+檢測提供了一種經濟省時的方法，并為環(huán)境安全和食品安全的目標物檢測應用提供了有力的實驗基礎。