陽 敬 蘭 慧* 吳其國 藍倫禮 莊晨曦 趙 佳

(1.紅河衛(wèi)生職業(yè)學院云南蒙自 661199；2.安慶醫(yī)藥高等?？茖W校安徽安慶 246052；3.桂林醫(yī)學院廣西桂林 541100)

蘆薈大黃素(Aloe Emodin)是中藥大黃中的有效成分，它廣泛存在于百合科蘆薈、豆科決明子及蓼科植物大黃中，具有抗菌、消炎、殺蟲、抗癌、抗衰老等功效[1]。蘆薈大黃素主要用于保健食品添加劑和食品染色劑。目前，對蘆薈大黃素的分析方法主要有高效液相色譜法[2]、分光光度法[3]及薄層色譜法[4]等。這些分析方法雖然應用廣泛，但其設備昂貴，前處理復雜。電化學方法因其儀器設備簡單，操作簡便靈活，低成本和靈敏度高并且不需要復雜的前處理，已被廣泛應用于實際樣品的檢測[5-7]。而采用電化學方法分析研究蘆薈大黃素報道較少。

納米材料具有良好的導電性及生物相容性，已經(jīng)應用于生物傳感器的構建中。石墨烯(GNs)具有大的比表面積、優(yōu)良的導電性、良好的電化學活性，有特殊的結構和優(yōu)異的力學、電學、光學及催化性能，在納米電子學、微電子學、儲能材料以及復合材料等領域具有廣泛的應用前景。同時，由于這種碳納米材料具有良好的導電性及生物相容性，已經(jīng)被廣泛應用于生物傳感器的制備及電催化領域。GNs已廣泛應用于電分析化學領域[8，9]。GNs基復合材料借助不同材料的協(xié)同作用，具有更快的電子遷移率、更大的比表面積和更好的生物相容性[10]。近年來，以GNs合成復合材料應用于電化學和生物傳感領域的報道已經(jīng)很常見。例如：ZnO-GNs[11]、TiO2-GNs[12]、WO3-還原氧化石墨烯(RGO)[13]等。但是GNs的片與片之間有較強的范德華力，容易聚集，這給GNs的研究和應用造成了極大的困難。因此，對其進行有效的功能化修飾非常重要[14]。聚多巴胺(PDA)是貝殼、蚌等生物分泌的粘性蛋白的主要成分，具有極強的粘附性，能穩(wěn)定地固定在各種基質上。Lee等[15]以多巴胺(DA)為單體，通過簡單的自聚合反應在各種基質表面形成了仿生PDA膜，該膜不僅具有良好的粘附性，同時保持了原有單體良好的生物相容性。PDA薄膜被廣泛地用于對Au和Pt納米顆粒、碳納米管、GNs氧化物的表面修飾。DA特有的還原性可以作為氧化石墨烯(GO)的還原劑。PDA良好的粘附性和生物相容性又可以作為GNs的保護劑。

本文合成石墨烯/聚多巴胺/金(GNs/PDA/Au)復合納米材料，采用紫外-可見吸收光譜、X射線衍射(XRD)、掃描電鏡(SEM)對合成的材料進行表征，并將制備的材料構建電化學傳感器用于檢測蘆薈大黃素。GNs大的比表面積有利于PDA的負載，PDA的引入既可以很好的改善RGO的水溶性，又可作為一個良好的連接劑，能夠很好的負載Au納米粒子，Au納米粒子負載的GNs/PDA復合納米材料中Au納米粒子具有良好的電化學活性，有利于電化學檢測性能的提高[16]。本研究采用循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)對影響蘆薈大黃素檢測的pH值、富集時間進行優(yōu)化，最佳條件為pH=5.72，富集時間280 s。方法可用于檢測大黃中的蘆薈大黃素，為進一步檢測此類藥品及保健食品的有效成分提供一條有效途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器(上海)有限公司)；DZF-60S0真空干燥箱(DZF-60S0上?？茖W儀器有限公司)；CP224C電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；HH-4水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠)；SK5200HP超聲波清洗器(上海科特超聲儀器有限公司)；AM1202-H數(shù)顯電動攪拌機(上海昂尼儀器)；TG18-WS離心機(上海島析實業(yè)有限公司)。

蘆薈大黃素對照品(批號：20140814)購自國藥集團上海化學試劑有限公司，大黃對照藥材(批號：20130909)購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；石墨烯(GNs)(阿拉丁試劑有限公司，8 000目)；HCl、檸檬酸三鈉、NaNO2、KMnO4、NaBH4、H2SO4、H3PO4、HAc、HAuCl4、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甲醇、NaOH、30%H2O2均為分析純。水為二次蒸餾水。

1.2 石墨烯/聚多巴胺(GNs/PDA)復合材料的制備

采用Hummers’方法[17]制備氧化石墨烯(GO)，取60 mg GO溶于80 mL水中，超聲分散2 h后，加入40 mg DA，冰浴超聲30 min，攪拌下加入40 mL pH=8.5的12.5 mmol/LTris-HCl緩沖溶液，于80 ℃反應48 h，用水離心清洗數(shù)次，直到除去多余的DA，產(chǎn)物溶于水中[18]。為了對比，本文還參考文獻方法制備了RGO納米材料[19]。

1.3 GNs/PDA/Au復合材料的制備

參考文獻報道的方法[20]制備GNs/PDA/Au復合納米材料，具體方法如下：取1 mL 10 mg/mL GNs/PDA納米復合物，加入10 mg HAuCl4(0.5 mL 20 mg/mL)和14.705 mg檸檬三酸鈉，整個溶劑的體積為40 mL，冰浴超聲30 min，冰浴中加入0.6 mol/L NaBH4，攪拌30 h，用水離心清洗后，備用。

1.4 傳感器構建

先將玻碳電極(GCE，直徑為3 mm)依次用1.0、0.3和0.05 μm/L的Al2O3粉末在麂皮上拋光成鏡面，然后分別在1.0 mol/L HNO3、無水乙醇和水中各超聲清洗1 min，室溫晾干。移取7 μL制備好的GNs/PDA/Au溶液滴涂在GCE表面，室溫晾干后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 電化學測試

采用三電極體系，以修飾GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，整個實驗在0.04 mol/L的H3PO4、H3BO4和HAc緩沖溶液中進行，循環(huán)伏安法實驗的電位掃描區(qū)間為-0.8～0.2 V，掃描速率為50 mV/s。

1.6 樣品提取

取大黃粉末0.5 g，加甲醇100 mL，浸泡1 h，過濾。取濾液25 mL，蒸干，殘渣加水50 mL使其溶解，再加5 mL HCl，加熱回流30 min，立即冷卻。用乙醚分兩次振搖提取，每次20 mL，合并乙醚層，蒸干，用三氯甲烷溶解后，置于50 mL容量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，置于4 ℃下[21]保存。

2 結果與討論

2.1 紫外-可見吸收光譜表征

采用紫外-可見分光光度計分別對GO、GNs、DA、GNs/PDA和GNs/PDA/Au進行光譜表征。如圖1所示，GO在波長230 nm處有最大吸收峰(曲線b)，GNs的吸收峰較GO的紅移了33 nm(曲線c)，表明GO已被成功的還原為GNs。從圖中曲線a可以看出DA在280 nm處有最大吸收峰，GNs/PDA在267 nm處有一個強的吸收峰(曲線d)，這是由于GNs與PDA之間的相互作用所致。GNs/PDA/Au在562 nm處出現(xiàn)了一個新的吸收峰(曲線e)，這個峰是Au納米粒子的吸收峰。表明成功制備了GNs/PDA/Au。

2.2 X射線衍射分析

采用pert3 powder型X射線衍射儀對GNs、GNs/PDA和GNs/PDA/Au進行X射線衍射(XRD)表征。從圖2a可以看出GNs在2θ=22.19° 附近出現(xiàn)一個新的寬衍射峰，這是由于化學還原后，移除了GO表面大量的含氧功能基團，使得層與層之間的晶面間距減小。同時GNs的衍射峰變寬，峰強度大大減弱，這是由于還原后片層尺寸更加縮小，晶體結構完整性進一步被破壞，無序度增加。圖2b是GNs/PDA的XRD圖，可以看到在2θ=24.9°處出現(xiàn)一個寬的衍射峰，與單純GNs的衍射峰形類似，表明GNs表面已成功的被PDA膜包裹。圖2c為GNs/PDA/Au的XRD圖，衍射峰位置分別為：2θ=38.20°、44.46°、64.56°、77.52°和81.70°，分別對應Au納米粒子的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)晶面。這個結果與文獻報道的Au納米粒子的XRD特征峰吻合[9]，表明Au的前驅液HAuCl4已被NaBH4成功還原成Au納米粒子。GNs/PDA/Au的XRD峰中GNs/PDA的XRD特征峰很不明顯，可能是因為Au納米粒子在GNs/PDA的表面負載密度太高，而掩蓋了GNs/PDA的峰。

圖1 DA(a)、GO(b)、GNs(c)、GNs/PDA(d)和GNs/PDA/Au(e)的紫外-可見(UV-Vis)光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra of DA(a)，GO(b)，GNs(c)，GNs/PDA(d) and GNs/PDA/Au(e)

圖2 GNs(a)、GNs/PDA(b)和GNs/PDA/Au(c)的X射線衍射(XRD)圖Fig.2 XRD patterns of GNs(a)，GNs/PDA(b) and GNs/PDA/Au(c)

2.3 GNs/PDA/Au的掃描電鏡表征

圖3A為GNs/PDA/Au復合納米材料的掃描電鏡(SEM)圖，可以看出Au納米粒子均勻分散在GNs/PDA表面，只有少量Au納米粒子有團聚現(xiàn)象。這可能是由于PDA作為一個良好的保護劑和連接劑有利于金納米粒子的均勻負載。圖3B為GNs/PDA/Au復合納米材料的透射電鏡(TEM)，可以看出Au納米粒子平均粒徑約為40 nm。表明成功地制備了GNs/PDA/Au復合納米材料。

圖3 GNs/PDA/Au的掃描電鏡(SEM)(A)和透射電鏡(TEM)(B)圖Fig.3 SEM image(A)and TEM image(B)of GNs/PDA/Au

2.4 蘆薈大黃素的電化學行為

考察不同材料修飾的電極在含有22.2 μmol/L蘆薈大黃素的B-R緩沖溶液(pH=5.72)中的循環(huán)伏安行為(圖4)。從圖中可以看出，GNs/GCE(a)和GNs/PDA/GCE(b)在含蘆薈大黃素的B-R緩沖溶液中無電化學響應，GNs/PDA/Au/GCE(c)在-0.6～-0.3 V之間有一對較好的可逆氧化還原峰，還原峰電位為-0.372 mV，氧化峰電位為-0.557 mV，其電位差ΔEp為185 mV。結果表明在陰極掃描過程中，蘆薈大黃素被還原成蒽氫醌化合物，然后又立刻被溶液中的溶解氧氧化為蘆薈大黃素，接著又在電極上被還原，從而形成一個催化循環(huán)[22]。從圖中還可以看出GNs/PDA/Au復合納米材料修飾后峰電流明顯增大，這表明GNs/PDA/Au不僅增大了電極的有效表面積，而且對蘆薈大黃素的氧化還原具有電催化作用。這可能是由于GNs的優(yōu)異的性能，以及Au納米粒子良好的電化學活性所致，可以加速蘆薈大黃素與電極表面之間電子的傳遞，從而顯著增加了氧化還原峰電流，提高了蘆薈大黃素電化學檢測性能。

2.5 pH的選擇

考察了B-R緩沖溶液pH對蘆薈大黃素檢測的影響。從圖5可知，隨著pH增大蘆薈大黃素的峰電流先逐漸增加，在pH=5.72時達到最大值，但繼續(xù)增加pH時，峰電流反而下降。選擇pH=5.72的B-R緩沖溶液為最佳檢測溶液。

圖4 蘆薈大黃素在不同修飾電極上的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of aloe emodin at different modified electrodesa:GNs modified glassy carbon electrodeb:GNs/PDA modified glassy carbon electrode；c:GNs/PDA/Au modified glassy carbon electrode.pH=5.72,t=280 s,scan rate:50 mV/s.

圖5 蘆薈大黃素GNs/PDA/Au上于不同pH B-R緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms of aloe emodin at GNs/PDA/Au in different pH B-R solutionpH:3.29、4.56、5.33、5.72、6.37.t=300 s,scan rate:50 mV/s,peak potential:-0.8--0.1 V.

2.6 富集時間的選擇

考察了GNs/PDA/Au/GCE在pH=5.72的B-R緩沖溶液中，采用差分脈沖伏安法(DPV)，對蘆薈大黃素富集時間的影響。結果表明，在60～280 s范圍內，隨著富集時間的增加，峰電流依次增加，繼續(xù)增大富集時間到320 s，峰電流反而減小。這可能是由于蘆薈大黃素在GNs/PDA/Au/GCE表面達到了飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加富集時間，會有部分蘆薈大黃素非特異性吸附在電極表面，阻礙電子的傳遞，導致峰電流降低。選擇280 s作為蘆薈大黃素的最佳富集時間。

2.7 修飾電極檢測蘆薈大黃素的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

在上述最佳條件下，采用DPV法檢測蘆薈大黃素。由圖6知，在pH=5.72的B-R緩沖溶液中，蘆薈大黃素在GNs/PDA/Au/GCE上的峰電流與其濃度在2.96～128.5 μmol/L范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為：Ip(μA)=0.78c(μmol/L)+5.62，線性相關系數(shù)是0.9928，線性檢測范圍是16.03～125.8 μmol/L，檢測限為4.82 μmol/L。本文方法與鄒洪等[23]報道的方法相比(線性范圍為3.0～28.6 mg/L，檢測限為0.06 mg/L)，檢測限更低，線性范圍更寬。

采用DPV法研究了GNs/PDA/Au/GCE的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，在pH=5.72的B-R緩沖溶液中，對濃度為24.67 μmol/L的蘆薈大黃素用同一支修飾電極連續(xù)測定6次，還原峰電流的相對標準偏差(RSD)為2.4%，將修飾電極放置于冰箱中保存，2周后測定上述溶液，響應峰電流變?yōu)樵瓉黼娏鞯?9.5%，表明該GNs/PDA/Au/GCE修飾電極具有很好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性。

圖6 (A)蘆薈大黃素在GNs/PDA/Au修飾電極上的差分脈沖伏安圖;(B)峰電流與蘆薈大黃素濃度的線性響應曲線Fig.6 (A)Differential pulse voltammograms of different concentrations of aloe emodin at GNs/PDA/Au modified electrode;(B)Linear response curve between peak current and aloe emodin concentrationc:2.96，7.4，11.1，16.03，22.2，29.6，51.8，66.6，83.87，103.6 and 125.8 μmol/L;pH=5.72,t:280s.scan rate:50 mV/s.

2.8 樣品分析及回收率

在pH=5.72的B-R緩沖溶液中，采用DPV法測定了大黃藥材中蘆薈大黃素的含量。取“1.6”中提取的樣品溶液進行測定，結果見表1。由表可得，用GN/PDA/Au/GCE修飾電極檢測到大黃藥材中蘆薈大黃素的含量平均為1.6 mg/g，與高效液相色譜法[24]測定的1.555 mg/g結果相一致。采用加標回收法對樣品進行測定，回收率為98.6%～102.1%。表明方法準確度較高，完全滿足實際樣品測定需求。

表1 蘆薈大黃素樣品的加標回收測定Table 1 Standard recovery results of aloe emodin in samples

3 結論

本實驗成功制備了GNs/PDA/Au復合納米材料，并用紫外-可見吸收光譜、X射線衍射、掃描電鏡對合成的材料進行表征。將GNs/PDA/Au復合納米材料構建電化學傳感器，用于對蘆薈大黃素進行檢測。采用循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)對影響蘆薈大黃素電化學行為的pH、富集時間進行優(yōu)化。實驗結果表明最佳pH為5.72，最佳富集時間為280 s。在最佳條件下，蘆薈大黃素檢測的線性范圍為16.03～125.8 μmol/L，檢測限為4.82 μmol/L，可用于藥物制劑中蘆薈大黃素的定量測定。該電化學檢測方法適用于對實際樣品的檢測，可應用到藥物分析中。