秦鳴蔚 張曉萌 靖 樂 宋玉竹 張金陽 夏雪山 韓芹芹

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院云南昆明 650500)

草甘膦(Glyphosate)是由美國(guó)Monsanto公司在1970年初推薦的一種高效水溶性低毒除草劑[1]。草甘膦的抗性作物占全世界每年種植的1.2億公頃轉(zhuǎn)基因作物的80%以上，但是用于轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的除草劑是否對(duì)這些作物和人類具有負(fù)面影響一直存在爭(zhēng)議[2，3]。草甘膦主要抑制植物體內(nèi)的膽堿酯酶，從而使其神經(jīng)系統(tǒng)受到干擾，致使植物死亡[4]。它主要用來控制一年或者多年生的雜草，是一種世界上生產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種。自1996年以來，由于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和油菜的生產(chǎn)，草甘膦使用量逐漸增加，所以其殘留問題日益嚴(yán)重[5]。過多的草甘膦會(huì)通過徑流、污水排放、大氣揮發(fā)等方式進(jìn)入到土壤、空氣和水中，這會(huì)導(dǎo)致自然環(huán)境中各種生物的死亡，并且通過食物鏈的傳遞而引起人類食物中毒[6，7]。嚴(yán)重時(shí)，可直接進(jìn)入到生物體內(nèi)，導(dǎo)致人急性嘔吐、慢性中毒和致畸[8]。

目前檢測(cè)草甘膦的方法主要有分光光度法、酶聯(lián)免疫分析法、氣相色譜法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法[9]等。但是這些方法存在容易受鹽離子的影響、成本高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、不易操作的缺點(diǎn)，對(duì)于草甘膦檢測(cè)具有一定的局限性[10]。所以建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低的有效檢測(cè)草甘膦的方法是非常有必要的。適配體相較于抗體而言有若干優(yōu)點(diǎn)，如較強(qiáng)的穩(wěn)定性、易于再生以及易于修飾，另外它們體積較小，可以在體外快速分離[11]。本文以草甘膦為靶標(biāo)，運(yùn)用體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)，從ssDNA文庫中篩選出特異性強(qiáng)、靈敏度高的核酸適配體[12，13]。這種核酸適配體可以初步檢測(cè)植物中的草甘膦，促進(jìn)基于核酸適配體快速檢測(cè)方法的應(yīng)用與發(fā)展,同時(shí)也為該試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器設(shè)備

TP600 PCR儀(日本，寶生物工程有限公司)；Tanon、EPS300電泳儀(Tanon(中國(guó)))；DelDocEz凝膠成像及分析系統(tǒng)(北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司)；BXP-530恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；BIOMATE3S分光光度計(jì)(Thermo)；VB-10型pH計(jì)(美國(guó)，丹佛儀器有限公司)；5424小型高速離心機(jī)(德國(guó)，Epperdorf)；純水儀(美國(guó)Millipore)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

草甘膦(韋佰力揚(yáng)化工集團(tuán))；親和填料Epoxy-activated Sepharose 6B(GE Healthcare,美國(guó))；ssDNA:5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG(N40)GATGGACGAATATCGTCTAGC-3′；正向引物P1:5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG-3′；反向引物P2:5′-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3′；M13-47引物:5′-CGCCAGGG1TrrCCCAGTCACGAC-3′(上海生物工程公司合成)；將隨機(jī)ssDNA文庫、P1、P2均用ddH2O配制成100 μmol/L溶液，貯存于-20 ℃冰箱中備用。NC膜(膜孔徑0.45 μm)(美國(guó)PALL公司)；pMD19-T、PCR所用試劑(日本TaKaRa公司)。偶聯(lián)緩沖溶液，1 mol/L氨基乙醇，結(jié)合溶液(10 mmol/L KCl)，洗脫溶液(不同濃度梯度)。

1.3 草甘膦的SELEX篩選

1.3.1 配基(草甘膦)與基質(zhì)的偶聯(lián)配基(草甘膦)與基質(zhì)(Epoxy-activated Sepharose 6B)的偶聯(lián)，方法參考GE Healthcare免疫親和色譜說明書。

1.3.2 ssDNA文庫純化將ssDNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，文庫擴(kuò)增后的產(chǎn)物直接與膠回收試劑盒的溶膠液按1∶1 比例混合進(jìn)行DNA片段回收。回收過后的DNA片段在金屬浴中于95 ℃加熱10 min，再冰浴10 min，使dsDNA變?yōu)閟sDNA。

PCR的反應(yīng)體系為3 μL ssDNA模板，2 μL正向引物(10 μmol/L)，2 μL反向引物(10 μmol/L),5 μL 1×PCR Buffer,3 μL MgCl2，4 μL 脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，30.6 μL超純水，0.4 μL Taq DNA聚合酶(最后加)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃變性5 min,95 ℃變性45 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進(jìn)行32輪循環(huán),然后72 ℃延伸7 min。

1.3.3 草甘膦核酸適配體的篩選將加入6 mL偶聯(lián)緩沖液洗脫偶聯(lián)過的基質(zhì)(核酸適配體)混勻后離心，去掉上清液，重復(fù)3次。純化好的100 μL ssDNA加到偶聯(lián)過的基質(zhì)中，在37 ℃(40 r/min)下孵育2 h。孵育后用2～3 mL超純水沖洗柱子，再用5 mL的洗脫溶液(20 mmol/L KCl)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集洗脫液(每管1 mL)。最后將洗脫液與膠回收的溶膠液按照等比例進(jìn)行混合，回收洗脫液，得到selex溶液。以膠回收產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用濃度2%的膠跑電泳進(jìn)行驗(yàn)證。所得的ssDNA為下一輪的篩選文庫，重復(fù)進(jìn)行6輪篩選。

1.4 圓二色譜法對(duì)K+濃度與草甘膦核酸適配體A08關(guān)系的探究

將草甘膦核酸適配體A08用濃度為20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.2)稀釋到20 μmol/L，在94 ℃變性30 min，以0.5 ℃/min的速度降至25 ℃。用含有不同濃度KCl溶液和20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH為7.2)的混合溶液，將草甘膦核酸適配體A08稀釋到2.5 μmol/L。于溫度25 ℃下，在波長(zhǎng)220～340 nm處用圓二色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 草甘膦核酸適配體A08最佳濃度的確定

將包被液與濃度為40 ng/μL的草甘膦溶液按照1∶1體積比，加入到有生物素標(biāo)記的適配體的96孔板中，進(jìn)行孵育、洗滌。用封閉液封閉非特異性結(jié)合的位點(diǎn)。再用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)將帶有生物素標(biāo)記的適配體稀釋成不同濃度，向96孔板每孔中加入100 μL適配體溶液，進(jìn)行孵育、洗滌。加入100 μL的HRP-Stretavidin(1∶1 000比例稀釋)，進(jìn)行孵育、洗滌。往每孔中加入顯色劑100 μL TMB溶液，在37 ℃條件下避光顯色10 min。將25 μL的2 mol/L H2SO4加入到96孔板中，并且在反應(yīng)結(jié)束前的10 min內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度。

1.6 草甘膦核酸適配體A08親和力和解離常數(shù)的測(cè)定

將20 ng/μL的草甘膦溶液與包被液按照1∶1的比例混合后，加入到96孔板中，每孔加入100 μL，用5%的脫脂奶進(jìn)行封閉后，加入不同濃度帶有生物素標(biāo)記的草甘膦適配體A08，加帶有鏈霉親和素的HRP進(jìn)行孵育，再加TMB進(jìn)行顯色，最終加入50 μL 2 mol/L H2SO4，在反應(yīng)終止的10 min內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 SELEX篩選和測(cè)序結(jié)果

圖1 草甘膦適配體通過SELEX技術(shù)經(jīng)過6輪篩選結(jié)果Fig.1 Results of glyphosate aptamers passed 6 rounds of screening by SELEX technique1：SELEX-One;2:SELEX-Two;3:SELEX-Three;4:SELEX-Four;5:SELEX-Five;6:SELEX-Six.

由于PCR過程中有可能會(huì)發(fā)生突變或其他導(dǎo)致序列的改變，因此需要通過克隆測(cè)序來確認(rèn)所擴(kuò)增的條帶是否為合適的序列，只有確認(rèn)之后才能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。首先將經(jīng)第6輪篩選得到的ssDNA進(jìn)行PCR，PCR過后進(jìn)行跑膠實(shí)驗(yàn)，過后進(jìn)行膠回收，收集目的片段。將目的片段與PMD19-T載體進(jìn)行連接，從-20 ℃冰箱取出感受態(tài)細(xì)胞后放冰上15～20 min。取10 μL的PMD19-T加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭吹打混勻，冰上放置30 min。再將水浴鍋調(diào)至42 ℃溫育90 s后，放置冰上5 min，加入890 μL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。37 ℃(100 r/min)搖菌1 h后，5 000 r/min離心3 min，舍棄500 μL上清液，然后吹打混勻。取200 μL進(jìn)行涂板，培養(yǎng)14 h后挑單克隆進(jìn)行菌液培養(yǎng)，將搖好的菌液進(jìn)行測(cè)序。

將ssDNA從親和層析柱Sepharose 6B洗脫下來，洗脫下來的溶液與膠回收溶液按照體積比1∶1混合，用TE溶液進(jìn)行洗脫。以洗脫的溶液為模板進(jìn)行PCR,然后對(duì)每一輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳。圖1為草甘膦適配體1～6輪篩選結(jié)果，從圖中可知得到了特異性較好的草甘膦適配體，適配體的長(zhǎng)度為82 bp。將篩選好的第6輪草甘膦適配體進(jìn)行跑膠，跑膠后進(jìn)行切膠，再與膠回收溶液1∶1進(jìn)行混合，用PMD19-T載體進(jìn)行單克隆過后進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)篩選后得到測(cè)序出現(xiàn)頻次高，且具有G-四鏈體結(jié)構(gòu)的草甘膦核酸適配體A08(表1)。

表1 草甘膦核酸適配體A08的序列Table 1 Sequence of glyphosate nucleic acid aptamer A08

圖2 草甘膦適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.2 Prediction structure of glyphosate aptamer secondary structure

2.2 草甘膦適配體A08二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

測(cè)序后的一組核酸序列通過Align X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，然后使用MFOLD(網(wǎng)址為http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)，在26 ℃，Na+濃度為150 mmol/L，Mg2+濃度為1 mmol/L的條件下預(yù)測(cè)適配體的結(jié)構(gòu)。再通過QGRS映射軟件(http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php)確定草甘膦適配體A08是否具有G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

在MFOLD和QGRS平臺(tái)上分析草甘膦適配體A08的二級(jí)結(jié)構(gòu)，它的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有突出的環(huán)和莖，并且存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能ΔG=-16.78(圖2)。因此該結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性。

2.3 圓二色譜法測(cè)定K+對(duì)核酸適配體A08的影響

圖3 核酸適配體A08在不同濃度K+條件下和在PBS中的圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism of nucleic acid aptamer A08 at different concentrations of K+ and in PBS

為了證實(shí)K+對(duì)適配體的結(jié)合活性是否有影響，通過圓二色譜法(CD)研究了適配體在K+結(jié)合之前和之后的構(gòu)象變化。圖3顯示K+具有極弱的CD信號(hào)，而適配體分別在約280 nm和245 nm處呈現(xiàn)正峰和負(fù)峰，這與報(bào)道的單鏈寡核苷酸的CD譜一致。當(dāng)游離的K+與適配體結(jié)合形成ssDNA-K+復(fù)合物時(shí)，280 nm與245 nm處的特征峰僅略微改變。這表明K+與適配體嵌入形式的結(jié)合并不會(huì)影響適配體的結(jié)合活性。

2.4 草甘膦核酸適配體A08的特異性

為了確定篩選出來的適配體A08是否具有特異性，本文采用了ELONA法測(cè)定帶有生物素標(biāo)記的草甘膦適配體A08在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度。將包被液和草甘膦按照1∶1體積比進(jìn)行混合，將混合液加入到96孔板上，使得每個(gè)孔的終濃度為40 ng/μL，每孔加100 μL，進(jìn)行孵育、洗滌。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陰性對(duì)照(對(duì)照組將草甘膦換成其他的結(jié)構(gòu)類似物)。在包被有草甘膦的96孔板上，每個(gè)孔加入100 μL封閉液，進(jìn)行孵育、洗滌。將帶有生物素標(biāo)記的草甘膦適配體A08稀釋至100 μL的工作濃度，進(jìn)行孵育、洗滌。加入100 μL 的HRP-Stretavidin(1∶1 000比例稀釋)，進(jìn)行孵育、洗滌。往每孔中加入顯色劑TMB溶液100 μL，在37 ℃條件下，避光顯色10 min。最后往每孔中加入25 μL 2 mol/L H2SO4，并且在反應(yīng)結(jié)束前的10 min內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度。如圖4所示，以脫脂奶和生物素作為空白對(duì)照，防止出現(xiàn)假陽性，以鵝膏毒素等作為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示草甘膦適配體A08只和草甘膦產(chǎn)生特異性結(jié)合。

采用Dot Blot法測(cè)定草甘膦核酸適配體A08的特異性[14]。如圖5所示，當(dāng)加入5 μL 40 ng/μL的草甘膦和100 nmol/L的草甘膦適配體A08時(shí)，草甘膦適配體與草甘膦特異性結(jié)合。

圖4 以脫脂奶、生物素作為空白對(duì)照和以其他毒素蛋白作為陰性對(duì)照的分析特異性Fig.4 Analytical specificity of glyphosate aptamers using skim milk,biotin as blank controls and other toxins and proteins as negative controls

圖5 草甘膦核酸適配體的特異性分析Fig.5 Specificity analysis of glyphosate nucleic acid aptamer

2.5 確定草甘膦核酸適配體A08最佳濃度

圖6 以脫脂奶和生物素作為空白對(duì)照的草甘膦核酸適配體最佳濃度Fig.6 Optimal concentration of glyphosate nucleic acid aptamers using skim milk and biotin as blank controls

為了確定草甘膦核酸適配體A08最佳濃度，在加入一定濃度草甘膦后，加入不同濃度適配體溶液。如圖6所示，當(dāng)草甘膦濃度確定時(shí)，草甘膦核酸適配體A08濃度為100 nmol/L時(shí)特異性達(dá)到飽和，因此草甘膦核酸適配體A08的最佳濃度為100 nmol/L。

2.6 測(cè)定草甘膦的靈敏度

為了確定測(cè)定草甘膦靈敏度，在加入100 nmol/L核酸適配體A08后，加入不同濃度的草甘膦溶液。如圖7所示，當(dāng)核酸適配體A08濃度確定時(shí)，草甘膦濃度為4 ng/μL 時(shí)具有特異性，結(jié)果表明適配體A08能檢測(cè)到草甘膦的檢測(cè)限為4 ng/μL。

2.7 草甘膦核酸適配體A08對(duì)靶標(biāo)親和力的測(cè)定

為了確定草甘膦核酸適配體A08對(duì)其靶標(biāo)的親和力，確定了解離常數(shù)(Kd值)。圖8顯示草甘膦適配體A08的解離常數(shù)Kd=38.38±9.094 nmol/L,得到飽和標(biāo)準(zhǔn)曲線，證明篩選的核酸適配體A08具有高親和力。

圖7 方法的靈敏度分析Fig.7 The sensitive analysis of this method using skim milk as a blank control

圖8 草甘膦核酸適配體與靶標(biāo)之間的親和力測(cè)定Fig.8 The determination of affinity between the nucleic acid aptamer and the target

2.8 檢測(cè)實(shí)際食物樣品中的草甘膦

為了證明ELONA法在檢測(cè)實(shí)際樣品中的準(zhǔn)確性和可行性，分別從四個(gè)不同的雜貨店購(gòu)買了可能含有草甘膦的食物，包括玉米、大豆、白菜、菠菜、板栗。首先進(jìn)行了亞硝化分光光度法測(cè)定，具體過程參照我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 20686-2006)，再通過ELONA法實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，ELONA法得到的回收率與國(guó)標(biāo)法測(cè)定的回收率一致，因此用ELONA法檢測(cè)食品中的草甘膦具有較高準(zhǔn)確性。

表2 食品中草甘膦含量測(cè)定方法的比較Table 2 Comparison of determination method of glyphosate in food

a:nitrosation spectrophotometry(national standard method);b:this method.

3 結(jié)論

本文通過SELEX技術(shù)篩選出一種具有高特異性、高親和力、高靈敏度的草甘膦核酸適配體A08，并且對(duì)它的特異性和靈敏度進(jìn)行了檢測(cè)。經(jīng)過多輪嚴(yán)苛條件下的篩選，確保適配體的特異性。通過ELONA試驗(yàn)證明篩選出來的適配體A08具有特異性。該技術(shù)為適配體的發(fā)展和應(yīng)用提供了新的方法和思路。