賈 杰 鄭瑞峰 李淑蘭 張道敬*

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室上海 200237；2.上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司上海 200237)

多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa,P.polymyxa)屬芽孢桿菌科(Bacillaceae)，為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，在劃入類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)之前又稱Bacilluspolymyxa。Ash等采用PCR探針對Bacillus的一些種進行了16S rRNA分析[1]，將其中的一些種歸到一個新屬Paenibacillus中，其中P.polymyxa就屬此列。本實驗室從南昌郊區(qū)番茄根際分離得到一株生防菌P.polymyxaHY96-2。由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)鑒定并保藏(保藏號為No.0829)。以生防菌多粘類芽孢桿菌HY96-2為主要活性成分，創(chuàng)制了世界上第一個以類芽孢桿菌為有效成分0.1億CFU/g多粘類芽孢桿菌細(xì)粒劑(農(nóng)藥登記證號：PD20096844)及10億CFU/g多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑(農(nóng)藥登記證號：PD20140273)系列微生物農(nóng)藥，該農(nóng)藥對青枯病、枯萎病、角斑病、炭疽病等植物土傳和葉部病害均具有良好的防治效果。

在P.polymyxa培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生大量的胞外多糖。研究表明，P.polymyxa產(chǎn)胞外多糖具有凈化水質(zhì)[2]、吸收水溶液中的鎘元素[3]、增強牲畜的低抗力和激活巨噬細(xì)胞等能力[4，5]。另外一些研究結(jié)果表明P.polymyxa產(chǎn)胞外多糖具有明顯的抗氧化活性[6-8]、促進小麥生長的功效[9]以及抗腫瘤活性[10]。與此同時，P.polymyxa產(chǎn)胞外多糖具有優(yōu)良的性質(zhì)，與市場上暢銷產(chǎn)品黃原膠特性相似，具有低濃度下高黏性、假塑性和耐鹽性，同時對熱及酸堿有較好的穩(wěn)定性[11]。目前，也有學(xué)者通過基因研究來提高P.polymyxa胞外多糖的產(chǎn)量[12]。P.polymyxa產(chǎn)胞外多糖在農(nóng)藥助劑方面也有一定的功能，但報道甚少。只有本研究室劉振華等研究過P.polymyxaHY96-2產(chǎn)胞外多糖在農(nóng)藥助劑方面的相關(guān)功能，包括助懸浮、紫外保護和熱保護作用[13，14]。但上述功能實驗所添加的是純度不高的粗多糖，其中含有相當(dāng)比例的雜質(zhì)。為了能得到純度較高的多糖，亟需開展多粘類芽孢桿菌HY96-2所產(chǎn)胞外多糖的分離純化，以明確胞外多糖的結(jié)構(gòu)、功能和用途。

目前分離多糖的主要手段是經(jīng)離心、抽濾、有機溶劑沉淀和去蛋白等步驟后得到粗多糖，而后再利用凝膠柱層析、離子交換柱層析等手段對粗多糖進行純化，得到較純的多糖樣品，然后對其進行結(jié)構(gòu)鑒定和理化性質(zhì)等方面的研究。一些文獻報道[7,8,15,16]都是通過這種方法來對多糖進行提純及分析的。其他菌種所產(chǎn)胞外多糖也大都采用此類方法進行分離純化[17]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的劉俊[19]對一株多粘類芽孢桿菌EJS-3產(chǎn)胞外多糖進行了類似的研究，通過紅外光譜、核磁共振等方法初步探究了EJS-3產(chǎn)胞外多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，但仍然未能完成對多糖結(jié)構(gòu)的解析。除此之外，南京理工大學(xué)的曹紅陽等[20]和蹇華麗等[21]也對多粘類芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖進行了結(jié)構(gòu)分析，但都局限于對多糖的構(gòu)型和其多糖種類進行判斷。本文中多糖的單糖組成分析與曹永強等[22]的研究類似，主要對P.polymyxaHY96-2產(chǎn)胞外多糖進行了分離純化，為其在農(nóng)藥助劑方面相關(guān)功能研究和大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑及材料

1200 series高效液相色譜儀(美國，Agilent)；GC-14BPF氣相色譜儀(日本，島津)；YM-75壓力蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HYG-Ⅱa迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜(上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司)；TU-1810紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；722可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；BSZ-100自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠)。

三氟乙酸、H2SO4、苯酚、HCl(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；NaOH、NaCl、葡萄糖(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。實驗中所用有機溶劑均為分析純。水由SZ-93蒸餾水制備儀(上海亞榮生化儀器廠)制備。

多粘類芽孢桿菌HY96-2，由華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖粗提取物的制備多糖粗提物的提取根據(jù)劉振華等[13]和夏泉等[18]的方法并加以改進：取HY96-2菌株發(fā)酵液，80 ℃水浴2 h，離心取上清，加入1倍體積的乙醇，生成的絮狀沉淀用水溶解后，再用1倍體積的乙醇沉淀，然后按沉淀∶Sevag試劑=5∶1的比例加入Sevag試劑，放置搖床中，以200 r/min搖10 min，取出，移至分液漏斗中靜置，分取水相(棄去有機相和水相交界處乳化層)，重復(fù)該步驟4次。將最后絮狀沉淀置于80 ℃烘箱烘干，得到多糖粗提物。

1.2.2 多糖的純化取多糖粗提物樣品2 g，用水還原至1 L，沸水加熱10 min后離心，取上清。向上清中加入10%的三氟乙酸，靜置5 h后離心，取上清并用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，而后用截留分子量為14 000的透析袋透析24 h，期間12 h換水一次。

將透析獲得的樣品配制成1.5 mg/mL的溶液，過DEAE-52離子交換柱。用8個濃度梯度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L)NaCl溶液進行洗脫，每個梯度用40根試管接收，每管接15 mL(利用自動分部收集器進行收集)，共收集320管，并測定第1、5、10、15……320根接收管中的多糖濃度。0 mol/L NaCl溶液洗脫的第20～25管合并后為組分B，0.5 mol/L NaCl溶液洗脫的第47～53管合并后為組分D。

1.2.3 多糖純度和分子量測定組分B和組分D分別經(jīng)高效液相色譜法檢測它們的純度，并利用pullulan多糖作為分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來測定它們的分子量。凝膠滲透色譜(GPC)用Shodex sugar KS 805、804兩根多糖專用色譜柱(柱長300 mm，內(nèi)徑8 mm，排阻限分別為5.0×106和4.0×105Da)串聯(lián)，以0.1 mol/L NaNO3溶液為流動相，流速為0.5 mL/min，溫度25 ℃，示差折光檢測器檢測。

1.2.4 多糖組分分析樣品預(yù)處理：取B組分15 mg(1.2.2項下所得，多糖純度91.4%)用14 000透析袋透析24 h(12 h換一次水)，所得樣品冷凍干燥，留作后續(xù)實驗。水解及衍生化：移取2 mg樣品，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸，封管，在110 ℃下加熱水解2 h，減壓蒸發(fā)除去三氟乙酸，將水解產(chǎn)物溶于2 mL 水中，加25 mg NaBH4，在室溫下還原3.5 h，滴加25%乙酸至不再有氣泡產(chǎn)生，減壓蒸干。加入乙酸酐2 mL，在100 ℃反應(yīng)1 h，反復(fù)加甲苯，減壓蒸發(fā)至完全干燥。用10 mL氯仿萃取，再以10 mL水洗滌3次，氯仿層用無水NaSO4干燥，然后減壓濃縮至適當(dāng)體積，進行氣相色譜(GC)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 DEAE-52離子交換柱洗脫結(jié)果

圖1 總糖濃度隨管數(shù)變化圖Fig.1 Total sugar concentration changes with the number of tubes

將1.2.2項下所獲得的樣品配制成1.5 mg/mL的溶液，過DEAE-52離子交換柱。經(jīng)1.2.2項下的方法進行梯度洗脫，每個梯度濃度NaCl溶液洗脫用40根試管接收，共得到320根接收管。測定第5、10、15……320號接收管中的總糖濃度。實驗結(jié)果顯示：總糖在少數(shù)幾根接收管中具有較高的濃度，如第10管、第50管、第120管和第265管，其總糖濃度分別為43.089 μg/mL、47.247 μg/mL、51.632 μg/mL和19.729 μg/mL，而這四根接收管是在不同梯度的NaCl溶液洗脫下得到的；即使在同一梯度下，經(jīng)NaCl溶液洗脫得到的多糖并沒有集中在個別接收管中，而是分布在不同的接收管中，可見各個接收管中的總糖濃度不盡相同。這些均說明不同濃度的NaCl溶液對HY96-2胞外多糖具有較好的洗脫效果。圖1直觀地反映出不同接收管中總糖濃度的區(qū)別，并且可以看出在不同濃度NaCl溶液的洗脫下，沒有出現(xiàn)總糖濃度高點相互重疊的現(xiàn)象，這更充分地說明了DEAE-52離子交換柱對多糖具有良好的分離效果。同時，利用不同濃度的NaCl溶液進行洗脫時，每個濃度梯度下都會出現(xiàn)總糖濃度較高的接收管。0 mol/L NaCl洗脫時，出現(xiàn)3個洗脫峰；0.5 mol/L NaCl洗脫時，出現(xiàn)2個洗脫峰；1.0 mol/L NaCl洗脫時，有4個洗脫峰；1.5 mol/L NaCl洗脫時，有1個洗脫峰；2.0 mol/L NaCl洗脫時，0個洗脫峰；2.5 mol/L NaCl洗脫時，有1個洗脫峰，NaCl洗脫濃度進一步提高時則沒有出現(xiàn)高濃度的總糖接收管。

為了進一步對分離得到的多糖進行分析，將出現(xiàn)洗脫峰及其鄰近的接收管進行合并。將獲得的A、B、C、D、E、F和G這7個組分進行真空冷凍干燥，稱重后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。從?可以看出，組分A、B和D是合并后的量比較多的3個組分，但根據(jù)冷凍干燥后各組分的色澤來看，由于A組分為第一個梯度洗脫下來的組分，顏色較深，而組分B、D從感官上可以看出色澤較淡，近無色，初步判斷較其它組分的純度要高，因此選擇組分B和D作為下一步的研究對象。

表1 高濃度總糖的合并與編號Table 1 The combination and numbering of high concentration total sugar

2.2 多糖純度和分子量的測定

在1.2.3項的實驗條件下測定組分B和組分D。組分B的GPC圖譜中主要有三個峰，保留時間分別為18.317 min、26.774 min和27.610 min，結(jié)果見圖2。組分D的GPC圖譜中主要有三個峰，保留時間分別為18.314 min、26.765 min和27.621 min，結(jié)果見圖3。根據(jù)圖2、圖3的峰面積分布，可得組分B純度：73.1786/(73.1786+6.8974)=91.39%；組分D純度：26.5574/(26.5574+21.4726)=55.29%。從結(jié)果可以看出，組分B的純度較組分D的純度高，所以選擇組分B進行進一步的分析。

根據(jù)GPC軟件計算，組分B位于18.317 min處的1#峰其多糖對應(yīng)重均分子量為1.22×106Da，位于26.774 min處的2#峰其多糖對應(yīng)重均分子量為2.42×103Da，源于寡糖或其他較小的分子，27.610 min處色譜峰為溶劑峰。

圖2 組分B的凝膠滲透色譜圖譜Fig.2 Gel permeation chromatogram of component B

圖3 組分D的凝膠滲透色譜圖Fig.3 Gel permeation chromatogram of component D

2.3 多糖組分B的單糖組成分析

根據(jù)2.2節(jié)中的結(jié)果，組分B的純度較高，采用1.2.4項的方法分析組分B中的單糖組成，得組分B的氣相色譜圖，如圖4所示。通過與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖進行比對和分析，出峰時間和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品分別對應(yīng)，即保留時間為5.383 min的為鼠李糖、7.976 min為木糖、15.178 min為甘露糖、16.640 min為半乳糖、18.146 min為葡萄糖，再根據(jù)面積歸一法確定單糖之間的摩爾比為2.52∶0.25∶1∶1.61∶2.24。從各單糖的摩爾比可以看出，其中所占比例較高的是葡萄糖和鼠李糖，這對于HY96-2產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵工藝的優(yōu)化具有指導(dǎo)作用，尤其是在進行培養(yǎng)基優(yōu)化時，可以優(yōu)先考慮利用葡萄糖和鼠李糖作為備選碳源來進行優(yōu)化以提高該組分的含量。

圖4 組分B的氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of component B

3 結(jié)論

經(jīng)過本文的研究，初步得到純度較高的HY96-2產(chǎn)胞外多糖，其中組分B的純度為91.4%，進一步對組分B的單糖組成進行了分析，發(fā)現(xiàn)其含有5種單糖：鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，它們的摩爾為2.52∶0.25∶1∶1.61∶2.24。為了更好的對其功能進行研究和開發(fā)利用，接下來將繼續(xù)對HY96-2產(chǎn)胞外多糖組分B進行深入結(jié)構(gòu)分析。同時，通過本文分離方法制備足夠量多糖來開展純品活性研究，以明確高純度多糖是否具備助懸浮、紫外保護和熱保護作用等功能，為HY96-2胞外多糖進一步應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。