蘇秀霞 徐 佳 張 婧 楊 冬 劉 歡

(1.陜西科技大學(xué)教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陜西西安 710021；2.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院陜西咸陽(yáng) 712000)

近年來(lái)，由于抗生素的濫用使得細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，從而導(dǎo)致許多“超級(jí)細(xì)菌”出現(xiàn)[1]。由于抗菌肽的殺菌機(jī)制與抗生素不同[2]，在殺死致病細(xì)菌的同時(shí)不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，因此抗菌肽在一定程度上可以取代抗生素。天蠶素作為一種最早被發(fā)現(xiàn)抗菌肽，能夠有效抑殺細(xì)菌[3，4]、病毒[5]、癌細(xì)胞[6，7]等，而且由于其良好的性能，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料添加劑、抗病基因等領(lǐng)域。目前檢測(cè)抗菌肽的主要方法有液晶生物傳感器[8-10]、免疫分析法[11]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[12]等。但是上述檢測(cè)手段存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高且靈敏度較低等問(wèn)題。因此，尋找一種具有靈敏度高、特異性好的檢測(cè)方法迫在眉睫。

液晶生物傳感器作為一種基于液晶垂直取向變化構(gòu)建的新型生物傳感器，由于其具有較高的靈敏度，良好的特異性，較低的檢測(cè)限，已被廣泛應(yīng)用于核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、重金屬離子等領(lǐng)域的檢測(cè)。張姣等[13]利用液晶所具有的雙折射特性構(gòu)建新型液晶免疫傳感器，并采用競(jìng)爭(zhēng)免疫法實(shí)現(xiàn)了對(duì)天蠶素B(CB)的檢測(cè)；Shen等[14]基于單鏈DNA之間的互補(bǔ)配對(duì)會(huì)造成基底表面形貌發(fā)生較大變化的原理，構(gòu)建了一種液晶生物傳感器并用于單鏈DNA的檢測(cè)；Yang等[15]利用液晶生物傳感器的高靈敏性實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的檢測(cè)，其通過(guò)誘導(dǎo)靶向DNA作為信號(hào)放大，使得Hg2+的檢測(cè)限低至0.1 nmol/L。

銀納米粒子(AgNPs)因?yàn)槠淞己玫纳锵嗳菪?，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)[16,17]、核酸[18]、重金屬離子[19]等的檢測(cè)。Wei等[20]基于AgNPs的等離子共振原理，實(shí)現(xiàn)了利用AgNPs比色法對(duì)小牛腸堿性磷酸酶A(CIAP)和蛋白激酶A(PKA)的檢測(cè)。當(dāng)存在CIAP或者PKA時(shí)，基底表面的三磷酸腺苷(ATP)將會(huì)被分解，使其無(wú)法將溶液中的AgNO3還原為AgNPs，而當(dāng)不存在CIAP或者PKA時(shí)，基底表面的ATP會(huì)將AgNO3還原為AgNPs，從而使溶液呈現(xiàn)淺黃色，CIAP的檢測(cè)限為1 U/mL，PKA的檢測(cè)限為0.02 U/mL。馮娟娟等[21]基于多巴胺可以還原AgNO3，發(fā)現(xiàn)多巴胺的濃度在0.05～16 μmol/L時(shí)，檢出限可低至0.04 μmol/L。本文結(jié)合AgNPs與液晶生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)，以AgNPs為信號(hào)放大器，構(gòu)建了一種新型生物傳感器并實(shí)現(xiàn)對(duì)微量CB的檢測(cè)。構(gòu)建的基于AgNPs信號(hào)放大的液晶生物傳感器檢測(cè)靈敏度高、特異性好，檢測(cè)限可以低至1.02 ng/mL。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XPL3230型透反兩用數(shù)碼偏光顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠)；Lambda25型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(珀金埃爾默責(zé)任有限公司)；SPI3800N/SPA400型原子力顯微鏡(日本，精工有限公司)；OCA20視頻光學(xué)接觸角(德國(guó)，Dataphysics公司)；載玻片(江蘇飛舟玻塑有限公司)；Mylar聚酯片(廣州市斯朗特電子科技有限公司)。

N,N-二甲基十八烷基(3-三甲氧基硅丙基)氯化銨(DMOAP)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(分析純，美國(guó)Sigma公司)；天蠶素B(CB)、天蠶素B抗體(anti-CB)(分析純，英國(guó)Abcam公司)；4-氰基-4-戊基聯(lián)苯(5CB)(分析純，美國(guó)Instec公司)；戊二醛(GA)、NaBH4、AgNO3(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 AgNPs的制備

在制備時(shí)所用的玻璃器皿及攪拌棒均需用新配制的王水浸泡。AgNPs的制備方法有很多，如化學(xué)還原法[22-25]、光催化法[26，27]、超聲還原法[28]等。最常用的方法是化學(xué)還原法中的檸檬酸鈉還原法[29，30]和NaBH4[25,31]還原法。本文采用Lee[25]的方法，以NaBH4作為還原劑，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整以制備出粒徑較小的AgNPs。在冰浴的條件下，將150 mL的NaHB4溶液(2.0 mmol/L)加入到三口燒瓶中，再將50 mL的 AgNPs溶液(2.5 mmol/L)快速加入到NaBH4溶液中。劇烈攪拌0.5 h后，升溫至80 ℃，反應(yīng)1 h 以除去溶液中多余的NaBH4。將所得黃綠色溶液冷卻至室溫后，加入200 μL 6.7 mmol/L的3-巰基丙酸(MPA)，攪拌12 h后，即可得到所需的AgNPs，移至儲(chǔ)瓶中備用(低溫避光儲(chǔ)存)。

1.3 玻片的預(yù)處理

將清洗干凈的玻片裁剪為2.5 cm×2.5 cm大小后，放入Piranha溶液(H2O2∶H2SO4=3∶7)浸泡 2 h，分別用超純水和乙醇沖洗干凈，并用氮?dú)獯蹈?，?10 ℃的條件下烘干3 h(注意防塵)，待用。

上玻片處理：將上述烘干待用的玻片浸泡在1%(體積分?jǐn)?shù))的DMOAP溶液中，在常溫下浸泡0.5 h后，用超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，?10 ℃下烘干2 h(注意防塵)。

下玻片處理：將上述烘干待用的玻片浸泡在APTES∶DMOAP=5∶1(V/V)的乙醇溶液中，在80 ℃下浸泡2 h，分別用超純水和乙醇沖洗干凈，氮?dú)獯蹈桑?10 ℃下烘干2 h，然后將其浸泡在含有2%(體積分?jǐn)?shù))GA的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)中，于37 ℃下浸泡1 h，分別用PBS和超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?注意防塵)。

1.4 AgNPs修飾CB復(fù)合物的制備

由于AgNPs具有極高的吸光系數(shù)，因此當(dāng)不同濃度的蛋白質(zhì)與AgNPs復(fù)合后，導(dǎo)致AgNPs微粒間距的不同，會(huì)出現(xiàn)從黃色到灰褐色至無(wú)色的顏色變化。因此，利用AgNPs的顏色變化這一性質(zhì)來(lái)確定anti-CB溶液的固定量[21]。蛋白質(zhì)與AgNPs復(fù)合時(shí)有兩種結(jié)合方式：共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合。非共價(jià)結(jié)合主要有氫鍵、范德華力、靜電作用等，共價(jià)結(jié)合一般是通過(guò)巰基實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和AgNPs的共價(jià)偶聯(lián)。由于anti-CB不含巰基，因此利用EDC/NHS使得AgNPs與anti-CB共價(jià)結(jié)合。

取1 mL的AgNPs，依次加入新配制的0.02 mmol/L的EDC溶液10 μL和0.1 mmol/L的NHS溶液5 μL，對(duì)AgNPs表面的羧基進(jìn)行活化，0.5 h后加入10 μL的anti-CB溶液(0.33 mg/mL)，混合搖勻后靜置2 h，使anti-CB中的氨基與AgNPs表面的羧基充分反應(yīng)，即AgNPs與anti-CB結(jié)合成功。

1.5 AgNPs修飾anti-CB復(fù)合物的固定

將100 μL不同濃度AgNPs修飾anti-CB的復(fù)合物溶液，滴加在經(jīng)下玻片處理的玻片表面，在恒溫?fù)u床中于37 ℃下反應(yīng)2 h，經(jīng)PBS(pH=7.4)和超純水沖洗以除去未固定的AgNPs修飾anti-CB的復(fù)合物，并用氮?dú)獯蹈?，冷藏保存?/p>

1.6 CB的檢測(cè)

在37 ℃下將經(jīng)處理的下玻片浸入60 mmoL/L甘氨酸溶液中0.5 h，以封閉未反應(yīng)完的醛基。然后將100 μL不同濃度的CB溶液滴加到經(jīng)甘氨酸處理的玻片表面，在恒溫?fù)u床中于37 ℃下反應(yīng)2 h后，使抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)PBS和超純水沖洗以除去未固定的CB，氮?dú)獯蹈?，冷藏保存?/p>

1.7 液晶池的制備

將經(jīng)步驟1.3節(jié)處理的玻片面對(duì)面組裝，兩玻片之間采用Mylar聚酯片隔開(kāi)，并將未開(kāi)孔的三個(gè)方向用夾子固定。將液晶(5CB)加熱至40 ℃，恒溫10 min，當(dāng)其從渾濁狀態(tài)變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)后，取8 μL從開(kāi)孔處加入到液晶池中。待液晶池自然冷卻至室溫后，利用偏光顯微鏡觀察其光學(xué)成像。

1.8 接觸角檢測(cè)

采用OCA20視頻光學(xué)接觸角測(cè)試儀測(cè)試基底表面的接觸角大小，用取樣器吸5 μL的超純水滴在基底表面，進(jìn)行測(cè)試。

1.9 基底表面原子力顯微鏡的測(cè)定

使用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)組裝有AgNPs修飾CB的基底表面進(jìn)行測(cè)試，AFM圖像以接觸模式獲得，掃描速率為1.2 Hz，掃描范圍為2 μm×2 μm。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

液晶生物傳感器的檢測(cè)原理如圖1所示。首先需對(duì)玻片表面進(jìn)行酸處理(圖a)，使得基底表面產(chǎn)生大量羥基，再利用APTES/DMOAP對(duì)基底表面進(jìn)行烷基化修飾(圖b)。DMOAP作為有機(jī)長(zhǎng)鏈可以對(duì)液晶分子的垂直取向形成有效誘導(dǎo)[32]。APTES+GA作為功能基團(tuán)可以將AgNPs修飾的anti-CB固定到基底表面(圖g)。CB可以與anti-CB發(fā)生特異性免疫，從而被固定到基底表面。與未使用信號(hào)放大的直接免疫法檢測(cè)天蠶素相比(圖f)，AgNPs具有較大的比表面積，可以對(duì)液晶的垂直取向形成更大的擾亂，起到信號(hào)放大的作用(圖j)。

圖1 基于AgNPs信號(hào)放大的液晶生物傳感器檢測(cè)原理圖Fig.1 Schematic diagram of liquid crystal biosensor detection based on AgNPs signal amplification

2.2 APTES/DMOAP/GA的比例優(yōu)化

基底的修飾將直接影響到液晶分子的排列方式，從而影響最終的光學(xué)成像。因此，需對(duì)APTES/DMOAP/GA的比例進(jìn)行優(yōu)化。DMOAP作為n>12的硅烷長(zhǎng)鏈，可以誘導(dǎo)液晶分子進(jìn)行垂直排列。APTES+GA作為功能基團(tuán)，用來(lái)將生物分子固定到基底表面。如圖2所示，當(dāng)APTES/DMOAP的比例(體積分?jǐn)?shù))較大時(shí)(圖2d、2e)，對(duì)液晶分子擾亂程度非常大，不利于下一步的觀測(cè)。而當(dāng)APTES/DMOAP的比例較小時(shí)(圖2a、2b)，雖然圖像背景為黑色，但不利于下一步GA的固定。因此，選取5∶1為APTES/DMOAP的最佳比例。

圖2 不同比例(體積分?jǐn)?shù))APTES/DMOAP的光學(xué)圖像Fig.2 Optical images of different volume fractions of APTES/DMOAP (a)1∶1;(b)3∶1;(c)5∶1;(d)15∶1;(e)25∶1.

GA的一個(gè)醛基與APTES的氨基反應(yīng)，而另一個(gè)醛基與anti-CB上的氨基反應(yīng)，從而將Anti-CB固定到基底表面。當(dāng)基底表面所固定GA越多，anti-CB被固定到基底表面的概率也將增大。因此，需對(duì)GA的含量進(jìn)行優(yōu)化。如圖3所示，當(dāng)GA含量過(guò)高(圖3c～3e)，液晶分子被極大地?cái)_亂，影響下一步的檢測(cè)，而當(dāng)GA含量為2%時(shí)，此時(shí)光學(xué)背景呈現(xiàn)黑色(圖3b)。因此，選擇GA最佳含量為2%。

圖3 不同GA含量的光學(xué)圖像Fig.3 Optical images of different GA contentsGA content(volume fraction)：(a) 0%;(b) 2%;(c) 4%;(d) 6%;(e) 8%.

2.3 基底接觸角表征

利用水接觸角測(cè)試儀對(duì)基底表面的接觸角進(jìn)行測(cè)試以確定APTES、DMOAP是否被固定到基底表面。如圖4所示，與裸玻片(圖4a)相比，加入DMOAP(圖4b)和APTES(圖4d)的接觸角都明顯增大，但是APTES的另一端為氨基，氨基作為親水基團(tuán)，使得其接觸角與DMOAP相比較小。APTES/DMOAP為APTES、DMOAP的混合溶液，因此接觸角應(yīng)介于APTES、DMOAP之間，圖4c與此相符。因此，可以進(jìn)一步確定APTES、DMOAP被固定到基底表面。

圖4 不同基底的接觸角Fig.4 Contact angle of different substrates(a)Slides;(b)DMOAP;(c)APTES/DMOAP;(d)APTES.

2.4 AgNPs的紫外-可見(jiàn)光譜表征

如圖5所示，在室溫下對(duì)AgNPs和AgNPs修飾anti-CB進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜表征。AgNPs的特征吸收峰在波長(zhǎng)390～440 nm之間，由于NaBH4作為還原劑，使得AgNPs的粒徑較小[33]，因此其特征吸收峰在394 nm處(圖5a)，即證明AgNPs制備成功。與圖5a相比，圖5b的吸收峰紅移了9 nm，且吸光度明顯下降，說(shuō)明anti-CB與AgNPs成功結(jié)合[34]。

2.5 原子力顯微鏡表征

為了進(jìn)一步觀測(cè)AgNPs修飾anti-CB與待測(cè)物CB是否固定在傳感器基底表面，我們對(duì)基底表面進(jìn)行原子力顯微鏡表征。如圖6所示，對(duì)比加入AgNPs修飾anti-CB復(fù)合溶液前后的圖像，可以發(fā)現(xiàn)在加入AgNPs修飾anti-CB復(fù)合溶液后(圖6b)，基底表面最高點(diǎn)到最低點(diǎn)間距(LVPH)明顯增大，為30 nm，且基底表面的粗糙度增大，表明AgNPs修飾anti-CB被固定在傳感器基底表面。

圖5 AgNPs與AgNPs修飾anti-CB的紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)光譜Fig.5 UV-Vis spectra of AgNPs and AgNPs modified anti-CB

圖6 不同基底表面原子力顯微鏡(AFM)圖Fig.6 AFM diagrams of different substrate surfaces(a)GA;(b)AgNPs modify anti-CB.

2.6 AgNPs修飾anti-CB含量的優(yōu)化

如圖7所示，當(dāng)AgNPs修飾anti-CB濃度過(guò)高時(shí)，液晶分子的垂直取向?qū)?huì)受到較大的干擾，在偏光顯微鏡下觀察到的光學(xué)圖像將會(huì)出現(xiàn)許多亮斑(圖7d、7e)，而當(dāng)AgNPs修飾anti-CB濃度太低時(shí)，無(wú)法對(duì)液晶分子的垂直排列造成影響，背景將為黑色(圖7a、7b)。因此，需要對(duì)AgNPs修飾anti-CB濃度進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)AgNPs修飾anti-CB的濃度為60 ng/mL時(shí)，所觀測(cè)的圖像為黑色，有利于待檢測(cè)CB的固定。因此，選擇AgNPs修飾anti-CB的最佳濃度為60 ng/mL。

圖7 固定不同濃度AgNPs修飾anti-CB的光學(xué)圖像Fig.7 Optical images of modified anti-CB with different concentrations of AgNPs (a)20 ng/mL;(b)60 ng/mL;(c)100 ng/mL;(d)200 ng/mL;(e)500 ng/mL.

2.7 CB的檢測(cè)

CB與anti-CB發(fā)生特異性免疫反應(yīng)后，可以有效地固定在玻片表面，通過(guò)觀測(cè)固定CB后的光學(xué)信號(hào)變化可以確定待檢測(cè)CB的濃度。如圖8所示，當(dāng)待檢測(cè)的CB濃度太高時(shí)(圖8e)圖像有大量的亮斑出現(xiàn)，當(dāng)待檢測(cè)的濃度過(guò)低時(shí)(圖8a)所固定的CB不足以影響液晶的取向，背景為全黑色。因此，待檢測(cè)CB的濃度為20 ng/mL以上，可以檢測(cè)出CB。

圖8 不同濃度CB的光學(xué)圖像Fig.8 Optical images of different concentrations of CB(a)10 ng/mL;(b)20 ng/mL;(c)40 ng/mL;(d)100 ng/mL;(e)500 ng/mL.

圖9 不同濃度CB的光學(xué)圖像及其所對(duì)應(yīng)的灰度值之間的關(guān)系Fig.9 Relationship between optical images of different concentrations of CB and their corresponding gray values

2.8 線性范圍和檢出限

為了進(jìn)一步對(duì)CB進(jìn)行定量檢測(cè)，探究了不同濃度CB的光學(xué)圖像，及其圖像與所對(duì)應(yīng)的灰度值之間的相關(guān)性。如圖9所示，隨著CB濃度的增加，其圖像所對(duì)應(yīng)的的灰度值亦隨之增大。結(jié)果表明：當(dāng)CB的濃度在10～100 ng/mL之間時(shí)，濃度與對(duì)應(yīng)圖像灰度值呈線性相關(guān)：y=0.353x+3.32,相關(guān)系數(shù)R2=0.995，檢出限為1.02 ng/mL。與其他方法相比檢出限[8]降低了49倍。

3 結(jié)論

本文采用銀納米粒子作為信號(hào)放大器，利用化學(xué)偶聯(lián)，成功修飾天蠶素B抗體，并用于對(duì)天蠶素B的檢測(cè)，與未采用銀納米粒子信號(hào)放大的方法相比，本文所采用方法的檢出限降低了49倍。