徐婭娟 黃 爍 李利軍 程 昊，黃文藝 馮 軍*，3

(1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院廣西柳州 545000;2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院廣西柳州 545006;3.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心廣西南寧 530004)

1977年，Jeanmaire和Van Duyne在粗糙的Ag電極表面發(fā)現(xiàn)拉曼信號(hào)強(qiáng)度異常增強(qiáng)，可以達(dá)到百萬(wàn)倍[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，少量貴金屬元素如Au、Ag和Cu自由電子類(lèi)金屬材料表面，可以表現(xiàn)出明顯的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，即表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)[2]。由于Ag納米粒子(AgNPs)容易制備，且與Au、Cu等其它材料相比，可獲得高出近100倍的增強(qiáng)效果[3]，因而成為SERS中最常見(jiàn)的研究對(duì)象。Fe3O4磁性納米粒子(MNPs)具有超順磁性，在復(fù)雜基體中具有很好的分離富集等功能，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[4]、成像[5]、生物分離[6]及催化[7]等領(lǐng)域。但是裸Fe3O4納米粒子易于氧化或聚集，且可溶于酸性溶液中，其活性基團(tuán)不足[8]，限制了它的應(yīng)用。有文獻(xiàn)報(bào)道[9，10]，F(xiàn)e3O4@SiO2納米復(fù)合物可以屏蔽磁偶極相互作用，避免顆粒團(tuán)聚，提高其穩(wěn)定性，已被廣泛用于SERS活性基底對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行快速檢測(cè)。但這種檢測(cè)方式繁瑣，檢測(cè)重復(fù)性差。同時(shí)，AgNPs相互之間所產(chǎn)生的“熱點(diǎn)”少，SERS活性較低[11，12]，靈敏度不高。因此，Hu等人制備出了Fe3O4@SiO2@AgNPs復(fù)合物作為SERS基底，并對(duì)其性能進(jìn)行研究，但該方法制備過(guò)程繁瑣、耗時(shí)，而且檢測(cè)效果不甚理想[13]。因此，改進(jìn)檢測(cè)重現(xiàn)性、提高靈敏度對(duì)于SERS的快速檢測(cè)仍然是亟待解決的問(wèn)題。

本研究采用層層自組裝方法，制備出一種高性能Fe3O4@SiO2@Ag納米復(fù)合材料，該材料以Fe3O4為核，以SiO2為殼層，構(gòu)建Fe3O4@SiO2“核-殼”結(jié)構(gòu)，利用Ag種的各向同性生長(zhǎng)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的穩(wěn)定作用形成AgNPs沉積在核殼結(jié)構(gòu)上，得到分散性良好、磁響應(yīng)好、靈敏度高、集成化Fe3O4@SiO2@Ag核殼結(jié)構(gòu)，并通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡、能譜及紅外光譜等手段對(duì)其進(jìn)行了性能表征。Fe3O4@SiO2@Ag作為SERS活性基底時(shí)，具有良好的超順磁性能，穩(wěn)定性好，AgNPs在核殼結(jié)構(gòu)上的均勻沉積，提高了檢測(cè)重復(fù)性。在此基礎(chǔ)上，本文建立了苯唑西林的SERS快速檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、高度集成、重現(xiàn)性好、靈敏度高，已經(jīng)成功用于各種劑型藥物中苯唑西林的快速測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Hitachi S-4800冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)；JEM 2100透射電子顯微鏡(日本，電子株式會(huì)社)；50max能譜儀(英國(guó)，牛津儀器)；Bruker D8A A25 X射線衍射儀(德國(guó)，布魯克公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)，Perkin Elmer公司)；XploRAPLUS激光共聚焦拉曼光譜儀(日本，Horiba公司)；XS105DU電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)。

苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品(20 mg/branch,上海邦景實(shí)業(yè)有限公司)溶液：精確稱(chēng)取4 mg苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品，用HCl(pH=3.0)定容于10 mL容量瓶中，并將上述溶液稀釋至所需濃度(10-3，10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10,10-11mol/L)待用。FeCl3·6H2O(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，AgNO3(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙二醇(廣東光華科技股份有限公司)，硅酸四乙酯(阿拉丁公司)，聚乙二醇4000(西隴化工股份有限公司)，NaAc(西隴科學(xué)股份有限公司)，氨水(西隴科學(xué)股份有限公司)，乙醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，所用試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純。實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

苯唑西林片(0.25 g/tablet，四川制藥制劑有限公司)，苯唑西林膠囊(0.25 g/pellet,四川制藥制劑有限公司)，苯唑西林粉針劑(0.5 g/branch,瑞陽(yáng)制藥有限公司)。

1.2 材料制備

1.2.1 Fe3O4的制備采用Modi化溶劑熱反應(yīng)[14]合成Fe3O4磁性納米粒子。將1.35 g FeCl3·6H2O溶于40 mL乙二醇中，磁力攪拌30 min。然后在所得溶液中加入2.7 g NaAc和1.0 g PEG 4000，攪拌至反應(yīng)物完全溶解，之后將該溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，放入烘箱中于210 ℃反應(yīng)6 h，取出后冷卻至室溫。制備的Fe3O4納米粒子用磁鐵收集，用水和乙醇各洗滌3次，放入60 ℃真空干燥箱干燥6 h，待用。

1.2.2 Fe3O4@SiO2納米粒子的制備稱(chēng)取0.5 g上述制備的Fe3O4,分散到60 mL無(wú)水乙醇以及12 mL水的混合溶液中，超聲20 min后，滴加2.8 mL氨水。然后在機(jī)械攪拌下逐滴加入2 mL TEOS(控制滴加速度為100 μL/min)。脈沖超聲反應(yīng)240 min，用磁鐵收集所得粒子，分別用乙醇和水各洗滌3次。放入60 ℃真空干燥箱中干燥12 h后，待用。

1.2.3 Fe3O4@SiO2@Ag納米復(fù)合材料的制備[15]將0.2 g AgNO3溶解在4 mL水中，加入400 μL氨水,超聲10 min。將30 mg Fe3O4@SiO2分散于該溶液中，然后加入溶解于無(wú)水乙醇(26 mL)的PVP(0.5 g)溶液，超聲20 min，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，于烘箱中120 ℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,在磁石吸附下用水和無(wú)水乙醇交替洗滌各3次后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥5 h，待用。

1.3 樣品制備及拉曼光譜采集參數(shù)

吸取待測(cè)樣品溶液500 μL，加入10 mg制備的納米復(fù)合材料，超聲1 h后，將混合溶液滴在外加磁場(chǎng)的石英玻片上晾干，每個(gè)樣品采集3次拉曼光譜。光譜參數(shù)：波長(zhǎng)為638 nm，積分時(shí)間為5 s，平均次數(shù)為1次。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)及能譜(EDS)表征

圖1(a～f)分別為Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@Ag的SEM、TEM和EDS表征結(jié)果。由圖1a可知，F(xiàn)e3O4(200 nm)大小均一、分散性好、表面光滑，且在能譜(圖1b)中只出現(xiàn)Fe、O元素的譜峰，說(shuō)明Fe3O4表面并沒(méi)有其他雜質(zhì)。用SiO2對(duì)Fe3O4進(jìn)行包覆后，F(xiàn)e3O4形成明顯的“核-殼”結(jié)構(gòu)，外層為透明的硅殼層(20 nm)，內(nèi)層為較暗的Fe3O4核(圖1c右上)，且在能譜(圖1d)中出現(xiàn)了Si元素的譜峰，這表明SiO2已成功包覆Fe3O4納米粒子。由Fe3O4@SiO2@Ag的SEM(圖1e)和TEM(圖1e右上)圖可以看到，AgNPs 均勻的點(diǎn)綴在Fe3O4@SiO2表面，很少觀察到較大的Ag顆粒，形成了具有納米級(jí)粗糙度的連續(xù)殼層，且在能譜(圖1f)中出現(xiàn)了Ag元素的譜峰，進(jìn)一步證明Fe3O4@SiO2@Ag得以成功制備。

圖1 掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)以及能譜(EDS)圖：(a、b)Fe3O4；(c、d)Fe3O4@SiO2；(e、f)Fe3O4@SiO2@AgFig.1 SEM，TEM and EDS results:(a，b)Fe3O4;(c，d)Fe3O4@SiO2;(e，f)Fe3O4@SiO2@Ag

2.2 X射線衍射(XRD)表征

采用XRD分別對(duì)Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@Ag進(jìn)行了表征。如圖2所示，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子(2a)和Fe3O4@SiO2(2b)均在2θ為18.4°、30.1°、35.5°、37.2°、43.1°、53.6°、57.0°、62.6°、74.1°處出現(xiàn)衍射峰。與標(biāo)準(zhǔn)PDF卡片(PDF01-1111)對(duì)比可知，這些峰分別歸屬于Fe3O4立方體結(jié)構(gòu)的(111)、(220)、(311)、(222)、(400)、(422)、(211)、(440)和(533)晶面[16]。這說(shuō)明在SiO2包覆Fe3O4的過(guò)程中，并沒(méi)有破壞Fe3O4磁性納米粒子的晶型結(jié)構(gòu)。Fe3O4@SiO2@Ag(圖3c)與Fe3O4的XRD譜圖對(duì)比，前者分別在2θ為38.2°、44.3°、64.5°和77.4°處出現(xiàn)新的衍射峰。與標(biāo)準(zhǔn)卡片(COD 9011607)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，這些衍射峰分別對(duì)應(yīng)Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，并且沒(méi)有破壞核殼結(jié)構(gòu)內(nèi)部Fe3O4的晶型結(jié)構(gòu)。這與前述SEM、TEM、EDS表征結(jié)果相符，表明Fe3O4@SiO2@Ag成功制備。

2.3 傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜表征

圖3分別為Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@Ag的紅外(IR)光譜圖。對(duì)比圖3a、3c可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4表面包覆SiO2后，在1 056 cm-1處出現(xiàn)明顯的特征峰，該吸收峰是由Si-O鍵伸縮振動(dòng)引起的[17]。進(jìn)一步沉積Ag后(圖3b)發(fā)現(xiàn)Si-O鍵吸收峰強(qiáng)度有所減弱，這是因?yàn)镕e3O4@SiO2表面沉積Ag較厚且覆蓋均勻引起的。這與Fe3O4@SiO2@Ag的SEM和TEM所觀察到的結(jié)果一致。

2.4 Fe3O4@SiO2@Ag SERS基底對(duì)藥物中苯唑西林的檢測(cè)

圖4為不同基底的拉曼光譜圖。從圖4a、4b、4c可以看出Fe3O4和Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@Ag 3種空白基底并沒(méi)有SERS信號(hào)，說(shuō)明對(duì)苯唑西林的SERS信號(hào)沒(méi)有干擾。由圖4d可見(jiàn)，苯唑西林在683 cm-1、1 036 cm-1、1 196 cm-1、1 501 cm-1、1 636 cm-1處均出現(xiàn)了拉曼譜峰，而在圖4f中在1 028 cm-1(羧基C-O鍵伸縮振動(dòng)引起)[18]、1 621 cm-1(苯環(huán)C-C鍵伸縮鍵振動(dòng)引起)[24]處拉曼譜峰顯著增強(qiáng)，與標(biāo)準(zhǔn)品(圖4d)比較后發(fā)現(xiàn)，這兩處峰發(fā)生了輕微紅移(大約10 cm-1)。這可能是由于基底的影響導(dǎo)致的，但并不影響該Fe3O4@SiO2@Ag基底對(duì)苯唑西林的檢測(cè)。

圖2 Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@Ag的X射線衍射(XRD)譜圖Fig.2 XRD patterns of Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2 and Fe3O4-@SiO2@Ag

圖3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@Ag的紅外(IR)光譜圖Fig.3 IR spectra of Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2 and Fe3O4-@SiO2@Ag

圖4 Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2@Ag(c)、苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品(d)、Ag-苯唑西林(10-3 mol/L)(e)和Fe3O4@SiO2@Ag-苯唑西林(10-3 mol/L)(f) SERS圖Fig.4 SERS of Fe3O4(a),Fe3O4@SiO2(b),Fe3O4@SiO2@Ag(c),Oxacillin standard;(d)Ag-oxacillin(10-3 mol/L)(e) and Fe3O4@SiO2@Ag-Oxacillin(10-3 mol/L)(f)

圖5 不同濃度的苯唑西林在Fe3O4@SiO2@Ag基底上的SERS圖Fig.5 SERS of different concentrations of oxacillin on Fe3O4@SiO2@Ag substrates

本文以1 028 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度作為I值，計(jì)算Fe3O4@SiO2@Ag基底對(duì)苯唑西林的增強(qiáng)因子為2.5×105。

光譜重現(xiàn)性是影響該方法有效性和實(shí)用性的重要因素[21]。對(duì)6份平行配制的1.0×10-9mol/L苯唑西林溶液進(jìn)行了拉曼檢測(cè)(圖6A)，考察苯唑西林在該基底上的光譜重現(xiàn)性，發(fā)現(xiàn)其在1 028 cm-1處拉曼信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為7.2%(圖6B)，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

圖6 (A)6組苯唑西林(10-9 mol/L)的SERS圖；(B)6份苯唑西林(10-9 mol/L)溶液在1 028 cm-1處的拉曼峰(誤差條表示三次測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差)Fig.6 (A) SERS of six groups of oxacillin(10-9 mol/L);(B) Raman peaks of six groups of oxacillin(10-9 mol/L) at 1 028 cm-1(error bars indicate the standard deviation of the three measurements)

2.5 不同劑型苯唑西林的SERS檢測(cè)

本文對(duì)苯唑西林粉針劑、膠囊、片劑分別進(jìn)行了檢測(cè)。首先，將苯唑西林膠囊(去其外殼)、片劑進(jìn)行研磨；然后，分別稱(chēng)取4 mg 3種不同劑型的苯唑西林樣品，用HCl(pH=3.0)定容于10 mL容量瓶中，待用。圖7為不同劑型的苯唑西林在Fe3O4@SiO2@Ag基底上的SERS圖。從圖中可以看出，不同劑型的苯唑西林與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，在1 028 cm-1、1 621 cm-1處均有較好的拉曼吸收,且膠囊的拉曼吸收相對(duì)較強(qiáng)，其次是片劑，粉針劑最弱。這可能是由于膠囊中苯唑西林含量較高，而片劑與粉針劑中含量較少。有研究表明，帶有巰基、氨基、苯環(huán)結(jié)構(gòu)的分子與Ag表面具有很強(qiáng)的化學(xué)親和力[22]。我們所制備的基底材料之所以能夠展現(xiàn)出優(yōu)異的抗干擾能力，歸因于該基底與目標(biāo)物的氨基、苯環(huán)結(jié)合之后，利用Fe3O4的超順磁性，可從復(fù)雜樣品溶液中快速分離富集苯唑西林分子，從而排除制劑中輔料的干擾。

圖7 (A)苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品(a)、膠囊(b)、片劑(c)和粉針劑(d)的SERS圖；(B)拉曼峰位于1 028 cm-1處的誤差分析圖Fig.7 (A)SERS of oxacillin standard (a),cachet(b),tablet(c) and powdery(d);(B)Error analysis diagram of Raman peak at 1 028 cm-1

3 結(jié)論

本文采用層層自組裝方法，制備了超順磁性、高SERS活性的Fe3O4@SiO2@Ag基底，并對(duì)其形貌與結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。該材料分散良好、磁響應(yīng)好、靈敏度高、集成化，可對(duì)待測(cè)目標(biāo)物進(jìn)行有效分離及富集，顯著提高了檢測(cè)靈敏度及抗干擾能力。在該SERS活性基底之上，苯唑西林檢測(cè)限達(dá)1.0×10-11mol/L，顯示該基底在食品、藥品的SERS快速檢測(cè)方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。