朱 哲，趙季紅，楊國紅，李 覃，候月輝，李玉明

近年研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在眾多非免疫源性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中處于核心地位，其功能和表型的多樣性和異質(zhì)性是它們在不同組織、不同疾病中發(fā)揮作用的病理生理學基礎，很大程度上影響著疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸[1]。張力反應性增強因子結(jié)合蛋白(tonicity-responsive enhancer binding protein, TonEBP)是細胞高滲應激的主要轉(zhuǎn)錄因子，控制高滲環(huán)境下影響細胞存活的關(guān)鍵基因的表達[2]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽刺激下小鼠巨噬細胞(Raw264.7細胞)的細胞活性、遷移能力、吞噬及增殖能力均顯著增強，同時伴有TonEBP表達水平的上調(diào)。目前有關(guān)TonEBP在巨噬細胞功能行使過程中發(fā)揮的作用尚不清楚，由此我們推測TonEBP可能是調(diào)節(jié)巨噬細胞功能學特性的潛在位點。本研究旨在明確TonEBP對巨噬細胞生理功能的影響，為進一步揭示巨噬細胞在相關(guān)疾病中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠Raw264.7細胞株由本實驗室提供，TonEBP基因沉默慢病毒載體設計構(gòu)建及包裝服務由上海合生基因生物公司提供；高糖培養(yǎng)液(DMEM)、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;嘌呤霉素(Puromycin)、碘化丙啶(PI)、高效RIPA組織/細胞快速裂解液(RIPA buffer high)、RNase A均購自北京索萊寶科技公司；CCK-8試劑盒購自中國碧云天公司；TRIzol購自日本TAKARA公司；5X All-IN-One RT MasterMix、SYBRGreen實時定量PCR試劑購于美國abcam公司；實驗所用抗體均購自美國Affinity 公司；Transwell購于美國Costar公司；紅色酵母多糖吞噬試劑盒(EZCellTM Phagocytosis AssayKit)購于美國BioVision公司；Model280酶標儀購于美國BIO-RAD公司；ABI 7300熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；CytomicsFC500流式細胞儀購于德國Beckmancoμlter公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將Raw264.7細胞置于10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，5%CO2、37 ℃恒溫恒濕條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗，待細胞長至80%密度大小時傳代。

1.2.2 慢病毒感染和篩選 針對小鼠TonEBP基因序列(ID:54446)設計3條帶有嘌呤霉素抗性的不同干擾靶點的RNA干擾慢病毒及1條空載慢病毒，慢病毒載體信息見表1。慢病毒感染及穩(wěn)定干擾TonEBP細胞株的建立， 將對數(shù)生長期細胞按5×104/孔接種于24孔板，感染前根據(jù)各組慢病毒滴度及預實驗確定的MOI值計算出需要加入的量，待細胞融合至50%時加入慢病毒進行感染。感染成功后繼續(xù)培養(yǎng)10 d，期間正常傳代，后以5 μg/ml嘌呤霉素篩選各組細胞，得到穩(wěn)定株后擴大培養(yǎng)。提取各組細胞RNA及蛋白，real time-PCR法檢測各組細胞TonEBP mRNA相對表達量(引物序列：TonEBP上游引物，5′-TTCATAGTTGGAATTTCAGAGCA-3′；下游引物，5′-TTGCGAGTATACAAATGTTCCAA-3′。GAPDH上游引物，5′-TAAGAGGGATGCTGCCCTTAC-3′；下游引物，5′-AATCCGTTCACACCGACCTT-3′)，Western blot法檢測各組細胞TonEBP蛋白表達量，將干擾效率最高的穩(wěn)定細胞株命名為TonEBP-shRNA組,空載慢病毒感染組細胞株命名為negative control(NC組)，野生型Raw264.7細胞株命名為wide type(WT組)進行后續(xù)實驗。

表1 shRNA慢病毒靶序列

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活性 將上述各組細胞以1×103/孔接種于96孔板，每組設5個復孔，重復3次。在細胞貼壁后(0 h),繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后棄原培養(yǎng)液，加入配制好的CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育2 h后用酶標儀檢測450 nm處吸光光度(A)值。細胞活力(%)=(干擾細胞OD-空白OD)/(對照細胞OD-空白OD)×100%

1.2.4 Transwell法檢測細胞遷移能力 選用8 μm孔徑的遷移小室，取對數(shù)生長期細胞，用無血清培養(yǎng)液按5×105/ml的密度重懸細胞后取200 μl加入上室，下室加入含10%胎牛血清培養(yǎng)液600 μl，培養(yǎng)24 h后取出小室，擦凈其上表面，無水乙醇固定15 min后用結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗3次，顯微鏡下隨機選取10個視野，計數(shù)每個視野下小室下表面細胞數(shù)，取平均值。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取各組對數(shù)生長期細胞5×105個，加入2 ml預冷的70%乙醇4 ℃固定30 min，洗滌1次后加入含有RNase A的PBS 500 μl，37 ℃孵育30 min后PBS洗滌1次，再加入配好的PI溶液，室溫避光孵育30 min，300目篩網(wǎng)過濾后上機檢測。用Modfit 4.0軟件分析各時相細胞比例，細胞增殖指數(shù)(proliferation index, PI，%)=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100%。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞吞噬能力 將各組細胞按2×105/孔接種于6孔板，每組設兩個復孔。細胞融合至80%后消化離心，棄上清，依次加入含10%FBS培養(yǎng)液200 μl及紅色酵母多糖(Red Zymosan) 5 μl后重懸，培養(yǎng)箱中開蓋孵育2 h后離心棄上清，500 μl吞噬測定緩沖液清洗3次后上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定干擾TonEBP細胞株的建立 慢病毒成功感染細胞后經(jīng)篩選得到穩(wěn)定株。測定各組穩(wěn)定細胞株中TonEBP mRNA及蛋白的相對表達量，結(jié)果顯示與正常組細胞相比，編號為pHS-ASR-LW222的病毒株干擾效率達70%以上(P<0.01，表2)，明顯高于其他慢病毒感染組，而pHS-ASR-LW198組與對照組相比，干擾效率無統(tǒng)計學差異(圖1)。

載體編號TonEBP mRNATonEBP蛋白正常細胞組1.000±0.0000.548±0.03pHS-ASR-LW1981.091±0.0820.581±0.03pHS-ASR-LW2220.163±0.028①②0.141±0.01①②pHS-ASR-LW2230.567±0.008①②0.365±0.02①②pHS-ASR-LW2240.506±0.092①②0.346±0.06①②

注:與正常細胞組比較，①P<0.01；與pHS-ASR-LW198組比較，②P<0.01

圖1 Western blot 法檢測細胞TonEBP蛋白表達

A.正常細胞組；B.pHS-ASR-LW198；C.pHS-ASR-LW222；D.pHS-ASR-LW223；E.pHS-ASR-LW224

2.2 CCK-8法檢測細胞活性 與WT組相比，TonEBP-shRNA組細胞增殖活性自24 h起降低(P<0.05)，NC組與WT組結(jié)果比較無統(tǒng)計學差異 (表3)。

組別WT組NC組TonEBP-shRNA組F00.31±0.020.31±0.040.33±0.030.63924 h0.46±0.010.45±0.010.39±0.02①②11.44748 h0.63±0.020.60±0.020.57±0.02①②5.30272 h1.01±0.111.00±0.080.71±0.02①②13.32096 h1.42±0.041.34±0.070.93±0.06①②61.080120 h1.56±0.091.50±0.151.26±0.06①②6.935

注：與WT組比較，①P<0.05；與NC組比較，②P<0.05

2.3 Transwell檢測細胞遷移能力 對各組小室下表面的細胞數(shù)進行計數(shù)，結(jié)果顯示TonEBP-shRNA組穿過小室的細胞數(shù)(88±7.00)明顯低于WT組(356±35.23),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，NC組(361±22.59)與WT組結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學意義 (圖2)。

圖2 Transwell法檢測各組細胞遷移功能(結(jié)晶紫染色，×200)

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 根據(jù)流式結(jié)果計算各組細胞增殖指數(shù)，結(jié)果顯示TonEBP-shRNA組細胞增殖指數(shù)(38.73±2.57)明顯低于WT組(50.20±2.29),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，NC組(51.44±1.20)與WT組比較結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(表4，圖3)。

組別G0/G1期G2/M期S期PIWT組49.81±2.299.92±0.7740.28±1.5450.20±2.29NC組48.56±1.199.77±1.3841.67±0.9551.44±1.20TonEBP-shRNA組61.26±2.56①②4.44±0.55①②34.30±2.06①②38.73±2.57①②F33.3831.5318.4033.33

注：與WT組比較，①P<0.01；與NC組比較，②P<0.05

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞吞噬能力 與WT組[(5.63±0.42)%]相比，TonEBP-shRNA組的吞噬能力明顯降低[(2.26±0.10) %],差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，NC組[(5.37±0.48%)]與WT組比較結(jié)果無統(tǒng)計學差異(圖4)。

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期

圖4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞吞噬能力

3 討 論

巨噬細胞作為機體固有免疫的重要組成部分，在抗炎、調(diào)節(jié)免疫方面發(fā)揮著十分重要的作用[3]。隨著對巨噬細胞研究的深入，我們認識到其功能作用的發(fā)揮不僅局限于免疫系統(tǒng)，在腫瘤[4]、動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)[5]、鹽敏感性高血壓[6]和糖尿病[7]等疾病的病程初期甚至整個病程都存在與巨噬細胞相關(guān)的炎性反應。如炎性反應初期，受到體內(nèi)炎性信號刺激后，巨噬細胞增殖活性明顯增強，大量巨噬細胞遷移至病變部位，通過吞噬病原體、分泌炎性介質(zhì)對抗感染、修復組織損傷、促進傷口愈合[8]。若巨噬細胞持續(xù)處于活化狀態(tài)，大量巨噬細胞遷移浸潤在組織中會誘發(fā)過度的炎性反應從而加重組織損傷[9]。如因顱腦外傷造成的腦部損傷中發(fā)現(xiàn)有巨噬細胞介導的炎性反應參與其中，可促進腦組織局部發(fā)生過度炎性反應，致使神經(jīng)元死亡最終導致機體行為和認知障礙[10]。研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)巨噬細胞免疫功能、減少細胞因子分泌，抑制其增殖活性、遷移、吞噬功能能夠減輕過度炎性反應，降低因過度炎性反應造成的負面影響[11]。另外，巨噬細胞介導的慢性炎性反應在眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，AS的病理改變是基于動脈壁的慢性無菌性炎性反應[12]。在AS早期，單核細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞，在跨越內(nèi)皮層后成熟為巨噬細胞，巨噬細胞局部增殖累積，吞噬脂質(zhì)后成為泡沫細胞，從而導致AS斑塊的逐步形成[13]。由此可見，若能在AS早期通過抑制巨噬細胞生理功能，降低其遷移、增殖及吞噬能力，或可防止斑塊的形成，一定程度上減緩AS的發(fā)生與發(fā)展，同時提示我們對巨噬細胞生理功能的調(diào)控或是防治此類病理改變的有效路徑。

TonEBP最初被定義為一種響應于高滲應激的調(diào)節(jié)蛋白，因細胞外鈉離子濃度升高而被激活[14]，保護細胞在高滲環(huán)境中免受損傷[15]。新的證據(jù)表明TonEBP還可因炎性刺激表達增強，通過影響細胞功能，在一些疾病的炎性階段發(fā)揮作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)TonEBP可以通過限制染色質(zhì)進入啟動子來抑制抗炎細胞因子IL-10的表達，從而促進炎性反應[16]。在類風濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，TonEBP單倍體缺失小鼠血管翳的形成較正常模型小鼠明顯減少[17]。隨著研究的深入，TonEBP與炎性反應之間的聯(lián)系被逐漸揭開，未來有關(guān)TonEBP與巨噬細胞之間的研究或是我們認識炎性疾病和免疫相關(guān)疾病的另一窗口。

本實驗利用慢病毒感染技術(shù)敲低Raw264.7細胞TonEBP的表達，在成功干擾小鼠巨噬細胞TonEBP表達后進行相關(guān)功能學實驗。CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)干擾細胞TonEBP表達后，細胞吸光光度值自24 h起至120 h均明顯低于正常組細胞，表明其活性較正常組細胞顯著降低；Transwell實驗結(jié)果顯示TonEBP敲低組細胞遷移數(shù)目較正常組細胞明顯減少，遷移能力下降；經(jīng)流式細胞術(shù)檢測細胞周期可知TonEBP敲低組細胞S期和G2/M期細胞比例較正常組顯著下降，細胞增殖能力降低；與此同時，流式結(jié)果顯示TonEBP敲低組細胞吞噬功能亦受到抑制，表現(xiàn)為對紅色酵母多糖的吞噬率顯著低于正常組細胞。

綜上所述，下調(diào)巨噬細胞TonEBP的表達，可降低其活性，抑制其增殖、遷移及吞噬功能，說明TonEBP對巨噬細胞的生理功能具有調(diào)控作用。如前所述，巨噬細胞生理功能的行使與多種炎性疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)?；诰奘杉毎谘仔苑磻械摹半p面性”，我們可嘗試通過TonEBP調(diào)節(jié)其遷移、吞噬、增殖等生理功能，干預由巨噬細胞介導的炎性反應，從而降低巨噬細胞在相關(guān)疾病某個病程階段所造成的不利影響，本實驗的研究結(jié)果為進一步探索TonEBP對巨噬細胞病理、生理的作用和機制提供了有力參考。