崔小康 駱菁菁 熊杰

摘 要：為制備模擬細胞外基質結構的微納尺度復合材料，利用靜電紡絲技術制備了聚己內酯（Polycaprolactone，PCL）微米纖維膜，通過與納米尺度的細菌纖維素（Bacterial Cellulose， BC）原位復合，制備了BC/PCL復合纖維支架。采用掃描電鏡、紅外光譜分析、X射線衍射分析對材料的形貌、結構進行了表征。通過單軸力學測試對復合材料力學性能進行了研究，并利用成纖維細胞對復合材料的生物相容性進行評價。結果表明：通過靜電紡絲法制備的PCL微米纖維的平均直徑，隨聚合物紡絲液質量分數的增加有增加的趨勢，BC與PCL微米纖維復合后，BC納米纖維滲透入微米纖維膜內部，實現微納米纖維較好的復合。紅外光譜分析和X射線衍射分析進一步證明BC和PCL微米纖維成功復合。PCL微米纖維膜復合BC膜后，相比PCL微米纖維膜增加了其斷裂強度，同時復合支架無明顯細胞毒性，可應用于生物醫(yī)學領域。

關鍵詞：細菌纖維素;聚己內酯;靜電紡絲;復合纖維材料;微米纖維膜

中圖分類號：TQ316.6

文獻標志碼：A

文章編號：1009-265X（2020）02-0001-07

Abstract：In order to prepare micro/nanoscale composites to mimic the structures of extracellular matrices， polycaprolactone （PCL） microfibrous membranes were prepared with electrospinning technology， and bacterial cellulose/polycaprolactone （BC/PCL） composite fibrous scaffolds were prepared by in situ compounding with nanoscale BC.The morphology and structure of the material were characterized by scanning electron microscopy， infrared spectroscopy and X-ray diffraction analysis.The mechanical properties of the composites were studied via uniaxial mechanical test， and the biocompatibility of the composites was evaluated via fibroblasts.The results showed that the average diameter of PCL microfibers prepared by electrospinning tends to increase with the increase of the mass fraction of polymer spinning solution.As to the combination of bacterial cellulose and PCL microfibers， BC nanofibers infiltrate into microfibers membrane to achieve composite of microfibers and nanofibers.Infrared spectrum analysis and X-ray diffraction analysis have further proved the success in the combination of BC and PCL microfibers.The breaking strength of composite membrane prepared by compounding PCL microfibers with BC membranes is higher in comparison with PCL microfibrous membrane.Meanwhile， the composite scaffolds don't exhibit obvious cytotoxicity， so they can be applied in biomedical field.

Key words：bacterial cellulose; polycaprolactone; electrospinning; composite fibrous material; microfibrous membranes

纖維素（Cellulose）是自然界最豐富的天然生物聚合物，由D-吡喃葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成。與植物纖維素相比，細菌纖維素（Bacterial Cellulose， BC）不含木質素和半纖維素，是由微生物在培養(yǎng)過程中形成的納米級超細纖維，其纖維膜具有高的孔隙率、機械強度、彈性模量、結晶度、純度以及良好的生物相容性等特點，是修復缺損組織良好的替代物?；贐C的獨特特性，大量研究對BC進行表面改性或與其他材料復合，以期獲得結構和功能可控的復合材料。BC基復合材料在傷口敷料、皮膚組織修復、人工血管和骨組織工程支架等領域具有良好的應用前景[1-2]Feng等[3]利用自組裝法制備BC/氧化石墨烯（BC/GO）復合膜，結果顯示GO納米片可均勻分散于BC基質中，與純BC膜相比，摻雜質量分數5% GO后的復合膜彈性模量和斷裂強度分別提高10%和20%。Zhang等[4]制備了聚乳酸-羥基乙酸共聚物/多壁碳納米管/BC（PLGA/MWNTs/BC）復合纖維膜，結果表明與純BC膜和PLGA/MWNTs膜相比，復合膜可促進牙周組織再生。

靜電紡絲法是制備連續(xù)微納米纖維的常用方法，通過調控制備工藝可獲得纖維直徑和纖維膜結構可控的支架材料。在眾多合成材料中，聚己內酯（Polycaprolactone，PCL）是美國FDA批準的可用于組織工程的線性脂肪族聚酯，由ε-己內酯開環(huán)聚合而成，具有良好的生物相容性、生物可降解性和可塑性。靜電紡PCL基纖維支架已用于皮膚、血管、骨、肌腱和神經等多種組織工程領域[5]。近年來，已有學者對BC/PCL復合材料進行了相關研究。Figueiredo等[6]將PCL粉末加入BC培養(yǎng)基中進行原位培養(yǎng)，復合材料進行熱壓后獲得BC/PCL復合膜。該復合膜中PCL填充了BC納米纖維之間的空隙，形成比純BC膜更致密的薄膜。Aydogdu等[7]通過靜電紡絲法制備了BC/PCL納米纖維膜用于傷口敷料。盡管該復合材料表現出較好的生物相容性，但纖維膜仍為致密的二維纖維網絡結構，限制了細胞在膜內的滲透生長和物質傳輸。LV等[8]提出在BC基復合材料的制備過程中擴大BC膜孔徑，利用馬鈴薯淀粉的糊化特性，在靜態(tài)培養(yǎng)過程中阻斷BC的組裝，研究發(fā)現形成的相互連接的大孔結構有利于肌肉細胞的滲透和血管的形成。

設計與構建模擬細胞外基質（ECM）結構和微納尺度的組織工程支架，是構建仿生支架材料的重要策略。本研究利用靜電紡絲法制備PCL微米纖維，通過微米尺度的PCL纖維膜與納米尺度的BC纖維原位復合，利用PCL微米纖維作為骨架引導BC超細納米纖維的形成，形成微納米結構復合的BC/PCL復合材料，整合微米纖維膜和超細纖維膜的性能特點，以利于細胞在復合材料中的滲透和長入，從而提高材料的生物相容性。本研究利用KES-G1單軸多功能拉伸儀測試復合材料的拉伸性能，研究BC納米纖維的原位合成對PCL微米纖維材料力學性能的影響，同時通過MTT法檢測復合材料的細胞相容性。研究結果將為組織工程用微納尺度復合材料的設計與開發(fā)奠定實驗基礎。

1 實 驗

1.1 實驗材料與儀器

實驗材料：PCL（Mw=80 000，Sigma-Aldrich），木醋桿菌（實驗室保存），三氯甲烷、甲醇和氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），高糖細胞培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素和胰酶（碧云天生物有限公司）。

實驗儀器：Ultra55場發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國ZEISS公司），ARL-X TRA型X-射線衍射儀（美國Thermo公司），GM-MAG HS7恒溫磁力攪拌器（德國IKA公司），FC60P2高壓電源（美國Glassman公司），KDS220微量注射泵（美國KD Scientific公司），KES-G1單軸多功能拉伸儀（日本Kato-Tech公司），ELx800酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜的制備

將PCL固體加入三氯甲烷/甲醇（體積比5∶1）混合溶液中配制成質量分數為10%、11%、12%的紡絲溶液，室溫條件下攪拌過夜，溶液轉移至10 mL注射器中，利用注射泵控制紡絲流率為10 mL/h，在電壓17 kV，紡絲距離為25 cm條件下進行靜電紡絲，并用滾筒接收裝置進行接收得到所需樣品。為得到BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜，將制備的PCL微米纖維膜紫外滅菌1 h，再置于培養(yǎng)基表面，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d后，用1% NaOH（W/V）溶液處理，ddH2O清洗及中和后得到復合膜。

1.2.2 復合膜表面形貌及結構表征

通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）對BC膜、靜電紡PCL微米纖維膜及其復合膜進行觀察。掃描電鏡觀察前，對樣品進行噴金處理。利用Image J（National Institute of Health）軟件對掃描電鏡照片進行纖維直徑分析，每種纖維材料選取5個樣品，每個樣品測量20根纖維。采用美國Thermo Nicolet公司的Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀對樣品的結構進行表征，其中BC膜和BC/PCL納米纖維復合膜通過自然干燥處理后待用，樣品取少量經溴化鉀研磨壓片制樣，掃描范圍為400～4 000 cm-1。采用X射線衍射儀（美國Thermo公司ARL-X TRA型）測定復合膜的成分，掃描速度為2°/min。

1.2.3 力學性能測試

BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜的力學性能用多功能測試儀的拉伸試驗來研究。測試環(huán)境為恒溫25 ℃，相對濕度60%，測試條件為0.1 mm/min的恒定拉伸速率進行測試。測試前將BC膜、PCL微米纖維膜及其復合膜剪裁成長度3 cm、寬度為5 mm的長方形，測試長度為2 cm，測試纖維膜的拉伸強度（σ）和斷裂伸長率（ε）。

1.2.4 細胞毒性實驗

利用小鼠成纖維細胞系NIH-3T3檢測材料細胞相容性，細胞用質量分數10 %胎牛血清的DMEM完全細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，每2 d更換細胞培養(yǎng)液，用0.25%胰酶消化液進行細胞傳代。BC膜、BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜剪成直徑6 mm圓片，置于96孔板中，紫外照射2 h，質量分數75%乙醇處理4 h，無菌磷酸緩沖液清洗3次，每次30 min，用無血清的細胞培養(yǎng)液浸泡過夜。隔天將細胞懸液以5×103個/孔加入96孔板中進行培養(yǎng)，分別在1、3、7 d取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μL四甲基偶氮唑鹽（3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide， MTT），置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去孵育液，加入150 μL DMSO于振蕩器上搖勻，充分溶解10 min，吸取100 μL于新96孔板中，利用酶標儀于490 nm波長下進行檢測。

1.2.5 細胞在支架上的形貌

成纖維細胞于材料上培養(yǎng)3 d后，對細胞-材料復合物進行染色，以觀察細胞在材料表面分布情況。首先將細胞-材料復合物用PBS洗3次，用質量分數4 %多聚甲醛進行固定40 min，接著用質量分數0.1% triton X-100處理增加細胞膜的通透性，PBS清洗2次，每次5 min。加入鬼筆環(huán)肽染色液進行染色1 h，吸去孵育液。染色后用PBS清洗3次，置于熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結果與討論

2.1 靜電紡PCL微米纖維形貌

圖1為不同質量分數PCL靜電紡微米纖維掃

圖1 不同質量分數條件下制備的PCL微米纖維掃描電鏡照片

描電鏡照片，通過調節(jié)PCL靜電紡絲紡絲液溶質量分數和紡絲參數，可制得微米級纖維支架。結果顯示，保持紡絲距離為25 cm時，PCL紡絲液質量分數對纖維形貌及直徑有一定影響。隨著PCL紡絲液質量分數增加，纖維平均直徑增加，由質量分數10%時的6.47±1.43 μm增加至7.02±0.55 μm（12%）。本文選擇溶質質量分數11%的紡絲液進行靜電紡絲，制備BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜（纖維平均直徑如表1所示）。

2.2 BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜的制備

通過將靜電紡微米纖維膜與BC原位復合，制得BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜，培養(yǎng)7 d后將復合膜經氫氧化鈉和去離子水處理。圖2為復合膜表面和截面的掃描電鏡照片。由圖2可見，BC的納米纖維可滲入微米纖維網絡內部。研究表明靜電紡膜孔徑與纖維直徑具有相關性，纖維膜孔徑隨纖維直徑的增加有增加的趨勢[9]。本文利用靜電紡技術獲得PCL微米纖維，在BC/PCL復合材料合成過程中，PCL微米纖維膜置于BC培養(yǎng)基表面，BC納米纖維至下而上生長，滲透入PCL微米纖維膜內部，向上生長過程中，形成PCL微米纖維與BC納米纖維緊密結合的復合膜，且實驗結果顯示微米纖維未影響菌株的生長，對形成的BC的形貌無明顯影響，為BC與微米纖維復合提供可行方式。

2.3 BC/PCL復合纖維膜的FTIR光譜分析

紅外光譜分析是表征物質中分子結構和化學鍵的一種分析方法。圖3為BC膜、靜電紡PCL微米纖維膜、BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜的紅外光譜圖。圖3可以看出純BC膜的特征峰，其中3 396 cm-1是OH的吸收峰，2 900 cm-1處的吸收峰對應于—CH2和—CH3基團的C—H伸縮振動峰。1 160 cm-1、1 058 cm-1處的吸收峰對應C—O—C對稱伸縮振動和C—O鍵的伸縮振動。PCL的特征峰為1 731 cm-1C—OO伸縮振動峰和1 240 cm-1處的C—O—C伸縮振動峰。BC與PCL纖維復合后，紅外光譜出現PCL1 731 cm-1和1 240 cm-1處的吸收峰，1 633 cm-1處吸收峰較強，為BC膜引起。結果表明復合膜中的BC與PCL微米纖維成功復合。

2.4 BC納米纖維/PCL微米纖維X射線衍射分析

圖4顯示BC膜、靜電紡PCL微米纖維膜、BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜的X-射線衍射圖譜。由圖4可見，PCL晶相衍射峰位于21.7°（110）和24.0°（200）[10]。BC位于14.9°（-110）和23.1°（200）有明顯衍射峰[1，11]。復合材料的衍射峰主要體現BC的特征衍射峰，在22.9°位置附近出現較純BC膜略寬的衍射峰，提示PCL微米纖維膜在BC膜內部。以上結果進一步證明復合膜中BC結構未因培養(yǎng)過程中PCL微米纖維的加入而產生影響。

2.5 BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜的力學性能

使用單軸多功能拉伸儀對纖維膜的抗拉強度和彈性模量進行了檢測（表2）。BC納米纖維膜斷裂應力為（154.85±9.57）MPa，文獻報道通過空氣干燥獲得的BC膜斷裂應力為129～198 MP[12]。BC纖維與PCL微米纖維復合后，相比PCL微米纖維膜應力增加285%，由（3.18±0.80）MPa 增加為（12.25±2.82）MPa。Cai等[13]將BC膜浸于膠原蛋白醋酸溶液，得到BC/膠原蛋白復合膜，力學測試結果表明，與純BC膜相比，斷裂強度由（200±18）MPa增加至（275±22）MPa，而應變由6.5±0.5%減小至3.75±0.55%。實驗結果證實BC膜具有較高的斷裂強度。PCL微米纖維膜復合BC膜后，相比PCL微米纖維膜增加了其斷裂強度，BC膜為增強項，但應變仍由BC為主要決定因素。

2.6 BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜的細胞相容性

細胞相容性是評價生物材料毒性的重要指標。通過MTT法檢測成纖維細胞NIH-3T3在材料表面的增殖情況，如圖5所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，吸光度增加，表明細胞在材料表面不斷增殖。細胞在不同支架表面的增殖情況無顯著差異，未表現明顯的細胞毒性。利用鬼筆環(huán)肽對NIH-3T3細胞的細胞骨架進行染色，通過熒光顯微鏡可觀察細胞在纖維支架表面的分布形態(tài)。如圖6所示，可觀察到細胞在各支架表面均能較好生長。細胞在BC納米纖維膜表面呈現鋪展的形態(tài)，而由于PCL微米纖維提供的三維大孔結構，細胞在PCL微米纖維膜表面呈現更為三維立體的形態(tài)，細胞分布不在同一平面而滲透入纖維網絡內部。在BC/PCL復合材料表面生長的細胞也表現為與PCL微米纖維膜上的細胞類似的形態(tài)，提示細胞可沿著微米纖維粘附以及向纖維內部伸展，從而呈現更為立體的分布形態(tài)。BC/PCL復合纖維膜的生物相容性優(yōu)于BC和PCL膜，相比BC納米纖維膜，細胞可向復合膜內部滲透生長，為復合膜提供更多的生長空間，而納米纖維與微米纖維結合，與PCL微米纖維膜相比，納米纖維提供與細胞相互作用的位點，因此BC/PCL復合膜具有更好的細胞相容性。

3 結 論

本文利用靜電紡絲技術制備PCL微米纖維膜，進一步與BC纖維原位復合，得到BC納米纖維/PCL微米纖維復合膜，BC纖維滲透于PCL微米纖維內部，與純PCL微米纖維膜相比，復合膜斷裂強度提高，且復合膜具有良好的細胞相容性。該方法為構建微納尺度組織工程支架提供了新策略。

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