傅慧靜 胡 霞 吳松青 王 榮 梁光紅 黃世國 張飛萍

(福建農(nóng)林大學林學院 福州 350002)

木質(zhì)纖維素是林木蛀干害蟲幼蟲階段的主要營養(yǎng)來源，在該類昆蟲的生長發(fā)育進程中起著重要作用(Jungetal.，2015；Petersonetal.，2015)。木質(zhì)素是木質(zhì)纖維素的主要成分(蔣挺大，2009；邱學青等，2013；De Gonzaloetal.，2016)，屬大分子物質(zhì)，性狀穩(wěn)定，不溶于水和絕大多數(shù)溶劑(陳躍輝，2013)，不能直接被昆蟲腸壁細胞吸收運轉(zhuǎn)。許多研究表明，昆蟲腸道微生物在木質(zhì)素生物降解過程中扮演著重要角色，其通過產(chǎn)生多種胞外酶推動木質(zhì)素裂解反應，形成可被吸收的小分子物質(zhì)(Buggetal.，2011；Wangetal.，2013；Lotfi，2014；Harithetal.，2014)。木質(zhì)素過氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)、錳過氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)和漆酶(laccase,Lac)被認為在木質(zhì)素降解過程中起重要作用，其活性反映了特定微生物的木質(zhì)素降解能力(陳躍輝，2013)。

長期以來，針對昆蟲腸道微生物產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的研究大多集中在真菌方面(喻云梅等，2005；彭木等，2014；Sanchez，2009)，但昆蟲腸道細菌也能夠降解木質(zhì)素。Delalibera 等(2005)在研究椴六點楔天牛(Saperdavestita)等昆蟲的腸道微生物多樣性時發(fā)現(xiàn)，源于椴六點楔天牛幼蟲腸道中的細菌既能降解濾紙，也能降解羧甲基纖維素;Schloss等(2006)研究表明光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)腸道中的放線菌具有降解木質(zhì)素類化合物的能力；Park(2007)等研究了9種天牛腸道細菌群落的多樣性，并在松褐天牛(Monochamusalternatus)腸道內(nèi)細菌降解木質(zhì)纖維素的研究過程中分離得到具有木質(zhì)素酶活性的變形菌門細菌(Gammaproteobacteria)；袁俊超等(2015)以試材木質(zhì)纖維為唯一碳源，從天牛幼蟲的腸道微生物菌群中篩選出3株能夠降解木質(zhì)纖維的菌株，同時發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)能協(xié)同煙曲霉(Aspergillusfunigatus)提高對木質(zhì)素的降解效率；李成林(2015)從4種食木白蟻腸道中篩選出可轉(zhuǎn)化利用木質(zhì)素類化合物的共生細菌。

除此之外，細菌還存活于許多其他種類昆蟲的腸道中，如棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、家蠶(Bombyxmori)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、美洲大蠊(Periplanetaamericana)、蜜蜂(Apiscerana)、桑天牛(Aprionagermari)、綠步甲(Carabussmaragdinus)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)等(何正波等，2001；相輝等，2008；王振鵬，2009；黃勝威，2012；楊樂樂，2013；劉曉飛，2015；郭軍等，2015；Crudenetal.，1984；Xiaetal.，2013；Huetal.，2017)，其中一些腸道細菌已被證明能夠產(chǎn)生1,4-β-內(nèi)切葡聚糖酶、1,4-β-木聚糖酶、果膠酶、α-淀粉酶等，具有促進昆蟲腸道消化吸收木質(zhì)纖維素、木聚糖、果膠和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的功能(Dillonetal.，2004)，但有關腸道細菌通過產(chǎn)木質(zhì)素降解酶分解木質(zhì)素的研究則較少。

沙雷氏菌(Serratiaspp.)隸屬于變形細菌門(Proteobacteria)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，通常存在于動植物、水、土壤和人體中。昆蟲也是該類細菌的宿存對象，如寬須蟻蝗(Myrmeleotettixpolpalis)、白蟻(Reticulitermeshesperus)、菜青蟲(Pierisrapae)、小菜蛾、南亞實蠅(Bactroceratau)、黑廣肩步甲(Calosomamaximoviczi)、華山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)和桑天牛等的腸道中均發(fā)現(xiàn)沙雷氏菌(金虹等，2005；姬小雪等，2009；李會平等，2012；夏曉峰等，2013；文竹等，2015；駱米娟等，2016；Thayer，1976)。有研究表明，該屬的一些種類具有木質(zhì)纖維素降解功能，如源于華山松大小蠹幼蟲腸道中的沙雷氏菌能夠分泌木質(zhì)纖維素酶(胡霞，2014)，Anand等(2010)發(fā)現(xiàn)液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)具有分泌木質(zhì)纖維素酶等多種胞外酶的能力，Perestelo等(1994)證實從堆肥中分離純化出的黏質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)具有降解木質(zhì)素的能力。然而有關昆蟲腸道沙雷氏菌木質(zhì)素降解功能的研究極少。

松褐天牛由于是松材線蟲病(Bursaphelenchusxylophilus)的主要傳播媒介而成為備受關注和危害極大的林木蛀干害蟲(陳順立等，1997；Zhaoetal.，2014)，其食物的主要成分為木質(zhì)纖維素。研究該蟲對木質(zhì)纖維素的吸收利用機制，有助于更好地理解其對寄主的適應性(王健敏等，2012)。筆者在前期研究該蟲腸道微生物的過程中，采用以羧甲基纖維素鈉作為唯一碳源培養(yǎng)，結(jié)合剛果紅法篩選纖維素降解細菌，發(fā)現(xiàn)了154株分別隸屬于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)8個屬的纖維素降解細菌，其中黏質(zhì)沙雷氏菌占比20.13%(胡霞等，2018)，屬于腸道優(yōu)勢細菌。為進一步探索該菌的功能及其作用機制，筆者研究其對木質(zhì)纖維素主要成分木質(zhì)素的降解功能，測定了其產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的情況，以及不同體外培養(yǎng)條件對其產(chǎn)優(yōu)勢木質(zhì)素降解酶——木質(zhì)素過氧化物酶的影響，以期為深入理解松褐天牛與該菌的協(xié)同作用提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 黏質(zhì)沙雷氏菌HX-3菌株分離自松褐天牛幼蟲腸道。松褐天牛幼蟲來源于福建省福州市連江縣琯頭鎮(zhèn)中榜水庫周邊的馬尾松(Pinusmassoniana)林(26.150°N，119.593°E)，并通過劈開馬尾松木段的方法收集(胡霞等，2018)，菌株低溫保存于實驗室。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 SOC培養(yǎng)基(胡霞，2014)：SOC 34 g；瓊脂12 g；蒸餾水1 000 mL。硫酸鹽木質(zhì)素產(chǎn)酶培養(yǎng)基(陳躍輝，2013)：KL(kraft lignin)3.0 g·L-1；(NH4)2SO42.0 g·L-1；K2HPO41.0 g·L-1；KH2PO41.0 g·L-1；MgSO40.2 g·L-1；CaCl20.1 g·L-1；FeSO40.05 g·L-1；MnSO40.02 g·L-1；pH7.0。該培養(yǎng)基中KL為唯一碳源。

1.2 試驗方法

1.2.1 活化菌種 將經(jīng)過純培養(yǎng)得到的黏質(zhì)沙雷氏菌單菌落接種在無菌SOC培養(yǎng)基內(nèi)，置于30 ℃恒溫、避光的條件下進行活化培養(yǎng)，并作為后續(xù)木質(zhì)素降解試驗的接種體。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將經(jīng)過活化后的黏質(zhì)沙雷氏菌接種于裝有70 mL硫酸鹽木質(zhì)素液體培養(yǎng)基的250 mL規(guī)格錐形瓶內(nèi)，200 r·min-1，30 ℃連續(xù)培養(yǎng)10天(Ahmad，2010)，每天定時定量取樣，并檢測其木質(zhì)素降解率與酶活性，3次重復。

1.2.3 黏質(zhì)沙雷氏菌對木質(zhì)素降解率的測定 以0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg·L-1的質(zhì)量濃度梯度配制木質(zhì)素磺酸鈣標準品溶液，在木質(zhì)素特征吸收峰280 nm處，分別檢測不同質(zhì)量濃度下各標準品的OD值(每個質(zhì)量濃度重復 3 次)，再以OD值為縱坐標，各質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并建立回歸分析直線方程(圖1)。每天于超凈工作臺內(nèi)，通過移液槍所吸取的液體培養(yǎng)基樣品，以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，取其上清液，測定各樣品在280 nm處的OD值(陳躍輝，2013；喬喬，2013)。最終依據(jù)標準曲線方程求解出目標菌株的木質(zhì)素質(zhì)量濃度，再代入下式計算出木質(zhì)素的降解率。

木質(zhì)素降解率=

圖1 木質(zhì)素標準曲線Fig.1 Standard curve of lignin

1.2.4 粗酶液的制備 取培養(yǎng)后的菌液，以4 ℃、10 000 r·min-1，離心5 min，取其上清液即為粗酶液。

1.2.5 黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶活性的測定 按照1.2.2的方法培養(yǎng)菌液發(fā)酵產(chǎn)酶，并于培養(yǎng)的第1—10天分別每日定時定量取樣以制備粗酶液。同時，以未接菌種的相同培養(yǎng)基作為空白對照(3次重復)。酶活力為酶促反應在單位時間內(nèi)釋放出1 μmol產(chǎn)物所需的酶量，定義為1個酶活單位(U·L-1)(Kapichetal.，2004)。

木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性檢測：依據(jù)相關學者的研究，選用藜蘆醇法(Mingetal.，1988)。具體為：首先，借助酶標儀設定30 ℃恒溫反應條件，利用移液槍分別吸取2 mmol·L-1VA 30 μL、50 mmol·L-1酒石酸鈉緩沖液(pH 2.5)139和30 μL的粗酶液于酶標板(CORNING，3590)上，隨后通過1 μL 0.4 mmol·L-1H2O2啟動體系的反應，并于310 nm的波長處讀取、記錄1 min內(nèi)體系OD值的變化。

錳過氧化物酶(MnP)活性檢測：參照Wariish等(1992)的相關研究，選用二價錳氧化法。首先，借助酶標儀設定30 ℃恒溫反應條件，利用移液槍分別吸取1 mmol·L-1MnSO430 μL、50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液(pH 4.5)139 μL和粗酶液30 μL于酶標板(CORNING，3590)上，隨后用1 μL 0.1 mmol·L-1H2O2啟動體系的反應，并于270 nm的波長處讀取、記錄1 min內(nèi)體系OD值的變化。

漆酶(Lac)活性檢測：參考Wolfenden等(1982)的研究，采用ABTS法。具體為：首先，借助酶標儀設定30 ℃恒溫反應條件，利用移液槍分別吸取1 mmol·L-1ABTS 30 μL和100 mmol·L-1的醋酸鈉緩沖液(pH5)140 μL于酶標板(CORNING，3590)上，后續(xù)用粗酶液30 μL啟動體系的反應，并于420 nm的波長處讀取、記錄1 min內(nèi)體系OD值的變化。

1.2.6 不同培養(yǎng)條件對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)Lip活性的影響 結(jié)合1.2.3和1.2.5研究結(jié)果，選擇活性最高的優(yōu)勢木質(zhì)素降解酶——LiP為對象，并選取產(chǎn)酶高峰期第4天的17:00為取樣時間，測定不同培養(yǎng)條件對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)酶活性的影響，3次重復。

不同木質(zhì)素質(zhì)量濃度的影響：以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎，分別設置9組不同濃度(質(zhì)量濃度)梯度的木質(zhì)素，具體為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0、20.0 g·L-1。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

不同pH值的影響：以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎，利用pH 計(上海奧豪斯儀器有限公司)通過1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)并設置7組不同的pH值處理，分別為pH4、5、6、7、8、9、10。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

不同氮源種類的影響：以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎，分別設置2組不同的氮源種類：有機氮源、無機氮源，有機氮源具體為蛋白胨(peptone)、酵母膏(yeast extracts)、干酪素(casein)；無機氮源具體為(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl、尿素[CO(NH2)2]。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

不同酵母膏(氮源)濃度的影響：基于不同氮源種類影響的研究結(jié)果顯示酵母膏產(chǎn)LiP的活性最強，故而選取酵母膏為氮源，進一步檢測不同氮源濃度對LiP酶活性的影響。同樣以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎，利用電子分析天平稱取酵母膏以設置7組不同的濃度(質(zhì)量濃度)處理，具體為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 g·L-1。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

不同金屬離子濃度的影響：以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎，通過電子分析天平稱取金屬化合物以分別設置5組不同的金屬離子濃度(質(zhì)量濃度)梯度處理，具體為Mg2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+。其中，MgSO4分別為0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g·L-1；CaCl2分別為0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 g·L-1；FeSO4分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20 g·L-1；MnSO4分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g·L-1；K2HPO4和KH2PO4的分別為0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 g·L-1。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件，利用單因素方差分析對試驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；通過Duncan檢驗作不同處理間的差異顯著性分析(P<0.05)；應用PRISM 5.0與ORIGIN 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏質(zhì)沙雷氏菌對木質(zhì)素的降解功能

通過10天的液體發(fā)酵培養(yǎng)，黏質(zhì)沙雷氏菌對硫酸鹽木質(zhì)素的降解情況見圖2。由圖可知，在木質(zhì)素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前4天，其木質(zhì)素降解率隨時間的延長而增加，只是前2天的累計降解率僅為10.90%；隨后在第4天達到降解高峰，單日降解率高達15.16%，并于維持3天的穩(wěn)定期后，累計降解率達到66.23%。第7天降解率開始銳減，且隨時間的推移降解率逐步降低，至第10天僅為3.98%，但累計降解率達到94.12%。上述結(jié)果說明，黏質(zhì)沙雷氏菌對木質(zhì)素具有顯著的降解能力。

圖2 松褐天牛幼蟲腸道黏質(zhì)沙雷氏菌木質(zhì)素降解率Fig.2 Rate on degrading lignin by S.marcescens in the larval gut of M.alternatus

2.2 黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶特性

黏質(zhì)沙雷氏菌在不同培養(yǎng)時期產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的情況見圖3。該菌在各階段產(chǎn)Lip酶的活性均最高，然后依次是MnP和Lac。對于Lip酶活性，初期伴隨著培養(yǎng)時間的推移而逐漸上升，于第4天達到峰值(214.67 U·L-1)，并在第5天開始呈現(xiàn)下降趨勢，至第10天其活性僅為36.26 U·L-1；對于MnP酶活性，初期2天的酶活性處于快速增長的階段，隨后3天增長趨勢則相對緩慢，但仍維持在較高的活性狀態(tài)，最高峰出現(xiàn)在第5天，為145.47 U·L-1，而后開始逐步下降。Lac酶在整個培養(yǎng)期間的活性始終處于較低水平，且僅在培養(yǎng)的第3天出現(xiàn)1個小高峰，活性也只達到16.88 U·L-1。結(jié)合圖2和圖3可知，黏質(zhì)沙雷氏菌對木質(zhì)素的降解率與其產(chǎn)LiP、MnP2 種酶活性的日變化趨勢相近，二者均在前期隨著培養(yǎng)時間延長而逐步升高，并均在第4—5天期間出現(xiàn)活性高峰期，隨后均逐步下降直至第10天。這說明黏質(zhì)沙雷氏菌主要通過產(chǎn)LiP、MnP2 種酶而實現(xiàn)其木質(zhì)素降解功能。

圖3 不同培養(yǎng)時間松褐天牛幼蟲腸道黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)酶曲線Fig.3 Curves of enzyme production by S.marcescens in the larval gut of M.alternatus with different culture time

2.3 不同培養(yǎng)條件對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)Lip活性的影響

2.3.1 不同木質(zhì)素濃度的影響 不同木質(zhì)素濃度下LiP活性見圖4。黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP的活性受木質(zhì)素濃度影響顯著(F=530.59，df=8，P<0.001)。當質(zhì)量濃度處于0～3 g·L-1之間時，LiP的活性隨木質(zhì)素濃度的增加而顯著提高，此后，伴隨濃度的進一步增加，LiP的活性反而逐漸轉(zhuǎn)弱。當木質(zhì)素質(zhì)量濃度為3 g·L-1時，酶活性達到峰值，且顯著大于其他濃度處理。但當木質(zhì)素質(zhì)量濃度處于20 g·L-1時，酶活性卻明顯弱于除對照外的其他濃度處理。

圖4 不同木質(zhì)素濃度下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.4 LiP activity from S.marcescens cultured with different conditions of lignin concentration圖中垂直線表示標準誤差，不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。下同。The vertical line represents the standard error,different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.The same below.

2.3.2 不同pH值的影響 不同pH值對LiP活性的影響見圖5。不同pH值對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP的活性存在極顯著差異(F=596.67，df=6，P<0.001)。處于偏酸性條件下的LiP活性顯著超出偏堿性條件下的酶活性，當pH值為5時的LiP活性最大(344.63 U·L-1)，且明顯比其他pH值處理領先；此外，而在pH≥8后的3個處理中，LiP活性均顯著低于其他pH值處理，說明堿性環(huán)境不利于黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP。

圖5 不同pH下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.5 LiP activity from S.marcescens cultured with different pH conditions

2.3.3 不同氮源的影響 由圖6可知不同氮源培養(yǎng)條件下LiP的活性情況：在有機氮源組中，蛋白胨、干酪素與酵母膏之間對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP活性的影響具有顯著差異(F=169.29，df=2，P<0.05)，當?shù)礊榻湍父鄷r，LiP活性最強(1 080.23 U·L-1)；氮源為干酪素時，LiP活性最弱(400.74 U·L-1)。在無機氮源組中，(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl與CO(NH2)2之間對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP活性的影響也存在顯著性差異(F=212.17，df=3，P<0.05)，其中氮源為CO(NH2)2時的LiP活性最強(374.07 U·L-1)，而氮源為 (NH4)2SO4時的LiP活性最弱(207.20 U·L-1)。從整體看來，有機氮源組的酶活性顯然強于無機氮源組，進一步表明有機氮源更適于黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP。

圖6 不同氮源下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.6 LiP activity from S.marcescens cultured with different sources of nitrogen

2.3.4 不同酵母膏(氮源)濃度的影響 不同酵母膏濃度對LiP活性的影響見圖7。酵母膏濃度對LiP活性具有顯著影響(F=437.83，df=6，P<0.05)。在1～5 g·L-1范圍內(nèi)，LiP活性隨酵母膏濃度增加而逐漸增大，尤其質(zhì)量濃度為5 g· L-1的LiP活性最高，達633.63 U·L-1，顯著高于其他各濃度處理；質(zhì)量濃度為1 g·L-1的LiP活性最低(237.84 U·L-1)。

圖7 不同酵母膏質(zhì)量濃度下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.7 LiP activity from S.marcescens cultured with different mass concentration of yeast extract

2.3.5 不同濃度金屬離子的影響 黏質(zhì)沙雷氏菌在各金屬離子不同濃度培養(yǎng)條件下產(chǎn)LiP活性如圖8。從圖可知，Mg2+濃度對該菌產(chǎn)LiP活性的影響達到顯著水平(F=399.94，df=5，P<0.05)，質(zhì)量濃度為0.20 g·L-1時的活性最高，達221.31 U·L-1，顯著高于其他各濃度處理；但當質(zhì)量濃度處于1.00 g·L-1時的活性最低，僅為64.20 U·L-1，顯著小于其他處理。

對于Ca2+，不同濃度之間差異顯著(F=206.63，df=5，P<0.05)。當質(zhì)量濃度為0～0.40 g·L-1時，隨著Ca2+濃度增加，LiP活性逐漸上升，在質(zhì)量濃度為0.40 g·L-1時的LiP活性最高(401.35 U·L-1)，顯著高于其他各濃度處理。

對于Fe2+，各濃度間也存在顯著性差異(F=288.14，df=4，P<0.05)，當質(zhì)量濃度處于0.15 g·L-1時，酶活性最強(448.04 U·L-1)，且明顯強于其他各處理。而當質(zhì)量濃度大于0.15 g·L-1時，酶活性則顯著降低，且當質(zhì)量濃度為0.20 g·L-1時的活性最低，僅為200.19 U·L-1，顯著低于其他各處理。

對于Mn2+，不同濃度對LiP活性也具有顯著影響(F=238.61，df=5，P<0.05)，當質(zhì)量濃度處于0.04 g·L-1時的酶活性最強(376.73 U·L-1)，且顯著強于其他各處理。但當Mn2+質(zhì)量濃度大于0.04 g·L-1后，酶活性卻迅速降低，并在質(zhì)量濃度處于0.10 g·L-1時的酶活性僅為171.95 U·L-1。

對于K+，各濃度之間存在顯著的差異(F=770.84，df=5，P<0.05)，當質(zhì)量濃度為0 g·L-1時，LiP活性最高(459.15 U·L-1)，顯著高于其他處理，并在質(zhì)量濃度0～5.00 g·L-1范圍內(nèi)，LiP活性隨著濃度增加而逐漸降低。

3 討論

黏質(zhì)沙雷氏菌在硫酸鹽木質(zhì)素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，對木質(zhì)素的累計降解率高達94.12%。這一結(jié)果證實來源于松褐天牛幼蟲腸道中的黏質(zhì)沙雷氏菌具備降解木質(zhì)素的功能，且該菌培養(yǎng)期間處于第4天時對木質(zhì)素的降解率最高(15.16%)，這可能因為培養(yǎng)初期為菌體細胞急劇增長的對數(shù)期，該時期的細菌又恰恰是細胞生長代謝活動最為旺盛的時期，而kraft木質(zhì)素正好作為菌株生長和代謝的唯一碳源被消耗利用，并為其后續(xù)的生長、發(fā)育、繁殖等生命活動提供能量。

圖8 不同Mg2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+離子質(zhì)量濃度下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.8 LiP activity from S.marcescens cultured with different concentrations of Mg2+,Ca2+,Fe2+,Mn2+,K+

作為高分子聚合物的木質(zhì)素直接進入單細胞細菌體內(nèi)存在一定的難度，故不少細菌往往會選擇通過分泌一系列胞外氧化酶這一與真菌相仿的方式完成對木質(zhì)素的生物降解(Ramachandraetal.,1988；Buggetal.,2011；Charles，2013；Harithetal.,2014)。引起木質(zhì)素降解的實質(zhì)是由于在C—C鍵裂解的最初階段能夠致使木質(zhì)素脫甲基形成含苯氧基自由離子，而這一氧化過程需要多種酶的協(xié)同作用(Deetal.,2016)。目前，國內(nèi)外多方面的研究資料表明主要有3種酶參與木質(zhì)素的降解，分別為LiP、MnP和Lac(Wangetal.,2013；Harithetal.,2014)。因而，這3種酶活性的強弱能在一定程度上衡量微生物降解木質(zhì)素的能力。

本研究說明黏質(zhì)沙雷氏菌能夠通過分泌LiP、MnP和Lac實現(xiàn)對木質(zhì)素的生物降解，其中LiP與MnP具有較高的活性，但Lac的活性在整個培養(yǎng)過程中始終處于較低的水平，僅在培養(yǎng)的第3天出現(xiàn)小高峰(16.88 U·L-1)，明顯低于LiP、MnP。而前兩者分別在培養(yǎng)第4天與第5天的活性達到峰值(LiP：214.67 U·L-1；MnP：145.47 U·L-1)，且其隨時間的變化趨勢與該菌對木質(zhì)素的降解率相吻合，這既說明黏質(zhì)沙雷氏菌可通過分泌LiP與MnP 2種胞外酶實現(xiàn)其木質(zhì)素降解功能，同時也證明并非每種菌都依賴這3種酶降解木質(zhì)素的說法(王靖等，2008)。

對特定種類的微生物，其木質(zhì)素降解功能與其宿存的微生態(tài)環(huán)境如微量元素、環(huán)境pH值、誘導劑、氮源種類及其濃度等密切相關(高大文等，2005；喬喬，2013；徐海濤，2014；Mikaelyanetal.,2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素濃度、pH值、氮源種類、氮源濃度與金屬離子及其濃度對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP活性均具有顯著影響，進而影響著其對木質(zhì)素的降解功能。當木質(zhì)素處于低濃度時，細菌降解木質(zhì)素的反應速率與木質(zhì)素濃度之間基本呈正相關。然而，隨著木質(zhì)素濃度增大，反應速率卻不再上升(金劍等，2010)，本研究中也存在類似情況，即該菌產(chǎn)LiP的活性并不伴隨木質(zhì)素濃度增加而增強，由此可見木質(zhì)素濃度與LiP活性之間并不是呈現(xiàn)出淺顯的線性關系，濃度越大并非對酶活性的提高越有優(yōu)勢。究其原因很可能是因木質(zhì)素濃度增加而導致降解環(huán)境隨之變得黏稠，阻礙體系內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的流通與氣體的流動，由此造成高濃度木質(zhì)素條件下細菌的生長效果反而不如低濃度時理想，從而表現(xiàn)為高濃度時的酶活性不強。

pH值是影響微生物產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的重要因素，如節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶的最佳pH值為7(張慶芳等，2014)，斜臥青霉菌P6(PenicilliumdocumbensP6)產(chǎn)LiP的最適pH為4.0(楊金水等，2004)，而本研究中發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌處于偏酸性環(huán)境中LiP活性較強，且最佳pH值為5，這同學者Ahmad(2010)所提出的觀點“微生物產(chǎn)LiP在低pH時效果更佳”不謀而合。已有多方面的研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素降解酶的合成與活性的強弱受培養(yǎng)基環(huán)境的pH影響較深。無論過高還是過低的pH值，均會顯著影響酶的活性(張慶芳等，2014)，這在本研究的分析中也得到了進一步的證實。

針對不同氮源對黃曲霉LDY(AspergillusflavusLDY)降解木質(zhì)素影響的研究表明，有機氮源的降解效果均劣于無機氮源(喬喬，2013)。本研究發(fā)現(xiàn)有機氮源比無機氮源更適于黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP，這說明不同微生物對不同種類氮源的利用能力具有差異。此外，秦嶺細粘束孢(Leptographiumqinlingensis)對寄主華山松金屬離子的營養(yǎng)具有高度選擇性(蒲曉娟等，2008)。而在本研究的分析中也發(fā)現(xiàn)不同金屬離子濃度對于黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)Lip活性具有顯著影響，對Mg2+、Mn2+與K+離子來說，處于高濃度時LiP活性顯然不如低濃度時的強，表現(xiàn)為抑制作用；而對于Ca2+與Fe2+，則表現(xiàn)為高濃度促進作用。以上結(jié)果說明黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)Lip時對于不同金屬離子的營養(yǎng)需求不同，進而可能進一步表現(xiàn)出對寄主樹木營養(yǎng)的選擇性。

本文為深入了解松褐天牛對寄主植物的營養(yǎng)適應機制提供了基礎依據(jù)。然而，關于該蟲腸道內(nèi)的其他微生態(tài)環(huán)境條件、該菌在寄主腸道內(nèi)產(chǎn)其他種類酶的情況以及與其他種類微生物的協(xié)同作用等，還有待于進一步地探索。

4 結(jié)論

黏質(zhì)沙雷氏菌具有較強的木質(zhì)素降解能力，可通過產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶實現(xiàn)其對木質(zhì)素的降解功能；培養(yǎng)基中木質(zhì)素濃度、pH值、氮源種類及其濃度、金屬離子及其濃度等對該菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶的活性均有顯著影響。