王松 李鵬程 白朝輝 許宏鑫 應(yīng)研敏 張墨 白義春

（1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌712100；3. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院全過程教學(xué)基地，新鄉(xiāng) 453000；4. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000；5. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

上皮鈉通道（Epithelial sodium channel，ENaC）是阿米洛利敏感性鈉離子通道［1］，廣泛分布于肺泡上皮細(xì)胞中，其主要功能是將Na+從頂膜攝入到極化的上皮細(xì)胞［2］，該過程伴隨著水和 Cl-的重吸收［3］，在肺泡腔水腫液清除（Alveolar fluid clearance，AFC）中起重要作用［4-5］。其中α亞基是ENaC的功能亞基，全身性敲除α-ENaC基因的小鼠因不能有效清除肺內(nèi)羊水而在出生40 h內(nèi)死亡［6］。對(duì)出生1 h的小鼠通過siRNA干擾α-ENaC基因的表達(dá)，肺泡腔水腫液顯著增加，同時(shí)小鼠的死亡率增加了4倍［7］。人的α-ENaC基因的某些堿基的突變，會(huì)導(dǎo)致肺泡腔液體不能有效清除而引起呼吸窘迫綜合征［8］。因此，肺泡α-ENaC蛋白的功能狀態(tài)對(duì)肺水清除有重要的影響。

近年來人們?cè)贖epG2細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞中研究還發(fā)現(xiàn)，α-ENaC蛋白還可能通過調(diào)控Na+流對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響［9-10］。同時(shí)α-ENaC蛋白還與雄性生殖系統(tǒng)有密切的聯(lián)系，可能參與精子活力的調(diào)控［11］。因此α-ENaC蛋白具有許多重要的生理功能。大鼠肺的α-ENaC蛋白主要分布于I型和II型肺泡上皮細(xì)胞［12］。II型肺泡上皮細(xì)胞是肺泡上皮細(xì)胞的干細(xì)胞［13］，在肺損傷時(shí)增生轉(zhuǎn)化為I型肺泡上皮細(xì)胞［14］。因此研究α-ENaC蛋白在II型肺泡上皮細(xì)胞中的作用具有重要的意義。但是原代分離的II型肺泡上皮細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)，隨著時(shí)間的推移，會(huì)逐漸分化為I型肺泡上皮細(xì)胞，而失去II型肺泡上皮細(xì)胞的一些生物學(xué)活性。L2細(xì)胞保留了大鼠II型肺泡上皮細(xì)胞的主要特征，是大鼠II型肺泡上皮細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除L2細(xì)胞α-ENaC基因的細(xì)胞株，這將為研究α-ENaC蛋白在II型肺泡上皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

CRISPR/Cas9骨架載體pll3.7-mU6-CMV-NLS-huCAS9-NLS（Cas9-Wild）、 擴(kuò) 增 導(dǎo) 向 RNA（guide RNA，gRNA）的載體JMB81-SP1.gRNA.opti和SSARPG報(bào)告載體骨架均來自西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院張智英老師實(shí)驗(yàn)室［15-16］；L2細(xì)胞（大鼠II型肺泡上皮細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)ATCC；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB；Protein ladder（美國(guó)Thermo Fisher Scientific，26617）；DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司，BM121）；質(zhì)粒提取試劑盒（美國(guó)Omega，D6943-01*）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國(guó)Omega，D2500-01）；pMDTM19-T 載體克隆試劑盒（日本TaKaRa，6013）；胎牛血清（以色列BI，04-001-1ACS）；F-12K培養(yǎng)基（美國(guó)ATCC，30-2004）；兔 源 SCNN1A（α-ENaC） 抗 體（ 美 國(guó) Affinity，DF9199）；辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（美國(guó)Affinity，S0001）；鼠源β-actin抗體（美國(guó)BOSTER，BM0627）和辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（美國(guó)Biolegend，405306，）；Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó) Thermo Fisher Scientific，11668-019）；CCK-8試劑盒（中國(guó)US EVERBRIGHT INC，C6005）。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建 利用在線分析軟件（http：//benchling.com），在α-ENaC基因的第一外顯子選擇3個(gè)靶位點(diǎn)：GCATGGGCTGAGGAGGACAAGGG，CAACAACACCACCATCCACGGGG和TGTCCTCCTCAGCCCATGCAAGG。3個(gè)靶位點(diǎn)的位置如圖1所示。上游引物分別為gRNA-α-ENaC-F1，gRNA-α-ENaC-F2 和 gRNA-α-ENaC-F3，下游引物同為gRNA-α-ENaC-R，引物序列見表1。以JMB81-SP1.gRNA.opti為模板，利用TouchDown程序PCR擴(kuò) 增 gRNA-α-ENaC。 將 gRNA-α-ENaC用BsaΙ和XhoΙ雙酶切插入到BamHΙ和XhoΙ雙酶切后的Cas9-Wild骨架中，得到靶向α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體α-ENaC.CRISPR/Cas9。

1.2.2 SSA-RPG報(bào)告載體的構(gòu)建 SSA-RPG報(bào)告載體骨架示意圖如圖2所示。載體中含有一個(gè)發(fā)紅光的DsRed基因，用于反應(yīng)轉(zhuǎn)染效率。CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)通過剪切肽T2A融合的PuroR和eGFP基因，PuroR基因中間插入靶位點(diǎn)而被打斷，靶位點(diǎn)兩側(cè)是重復(fù)序列，因此PuroR和eGFP不表達(dá)（圖2-A），當(dāng)靶位點(diǎn)被切割后，PuroR通過細(xì)胞內(nèi)源的單鏈退火（Single-strand anealing，SSA）修復(fù)機(jī)制，恢復(fù)表達(dá)，eGFP隨之表達(dá)，細(xì)胞表現(xiàn)出Puro抗性并發(fā)出綠色熒光（圖2-B），因此綠色熒光可以反應(yīng)核酸酶的切割活性。

圖1 α-ENaC基因3個(gè)靶位點(diǎn)位置

表1 構(gòu)建載體所需引物序列

圖2 SSA-RPG報(bào)告載體示意圖

構(gòu)建3組報(bào)告載體的靶點(diǎn)引物分別為：targetα-ENaC-F1 和 target-α-ENaC-R1 ；target-α-ENaC-F2和 target-α-ENaC-R2 ；target-α-ENaC-F3 和 target-α-ENaC-R3，引物序列見表1。為了便于檢測(cè)，在靶位點(diǎn)前面插入XhoΙ酶切位點(diǎn)。將target-α-ENaC-F/target-α-ENaC-R 引 物 擬 合 后， 插 入 到NotΙ 和BamHΙ雙酶切后的SSA-RPG報(bào)告載體骨架中，獲得α-ENaC基因的報(bào)告載體α-ENaC.SSA-RPG。

1.2.3 HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染及CRISPR/Cas9表達(dá)載體的活性檢測(cè) HEK293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，利用Lipofectamine?2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染3組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分別為 ：α-ENaC.CRISPR/Cas9-1+α-ENaC.SSARPG-1，α-ENaC.CRISPR/Cas9-2+α-ENaC.SSA-RPG-2，α-ENaC.CRISPR/Cas9-3 +α-ENaC.SSA-RPG-3。48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)，并用流式細(xì)胞儀對(duì)DsRed+和GFP+陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。DsRed+代表被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，DsRed+GFP+代表CRISPR/Cas9表達(dá)載體有活性的細(xì)胞，因此DsRed+GFP+/DsRed+代表CRISPR/Cas9表達(dá)載體活性的大小。

1.2.4 L2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 L2細(xì)胞用含10% FBS的F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染條件同HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染兩組質(zhì)粒，對(duì)照組質(zhì)粒Cas9-wild+α-ENaC.SSA-RPG-3和以上篩選出的CRISPR/Cas9活性較高的實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒α-ENaC.CRISPR/Cas9-3+α-ENaC.SSA-RPG-3。

1.2.5 嘌呤霉素篩選 L2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞中加入終濃度為3 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，每天換液，連續(xù)篩選5 d，將細(xì)胞移入10 cm的培養(yǎng)皿中，撤去嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆。

1.2.6 Western Blot檢測(cè) 將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，裂解液4℃裂解，12 000 r/min離心，提取總蛋白，用Bradford法測(cè)量蛋白濃度。變性后的蛋白樣本等質(zhì)量上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳（80 V，30min；120 V，50 min），用孔徑 0.45 μm 的 PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（300 mA，90 min），5%脫脂牛奶封閉30 min后，分別用稀釋好的α-ENaC抗體和β-actin抗體4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次/10 min，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體和羊抗鼠IgG抗體室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗3次后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.2.7 突變結(jié)果檢測(cè) 將α-ENaC蛋白表達(dá)量下降或無蛋白表達(dá)的單克隆細(xì)胞用SDS堿裂解法提取基因組DNA，以該基因組DNA為模板，分別 以 F1：CCCCATTCTGCCTTCACGCTA，R1：TCCTCGAACAGCAAGGCGAAC為上下游引物，PCR擴(kuò)增靶位點(diǎn)附近的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序峰圖為雜峰的PCR產(chǎn)物連接到pMDTM19-T載體上，進(jìn)一步測(cè)序檢測(cè)。

1.2.8 脫靶檢測(cè) 為了檢測(cè)該CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，考慮到脫靶現(xiàn)象的位置效應(yīng)結(jié)合α-ENaC基因的特點(diǎn)，挑選α-ENaC基因高度同源的亞單位β-ENaC基因和γ-ENaC基因4個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，分別為：AGGGCCCAGGCTACACCTACAAGG，T C T C C C C A C T T A G G T A C T C C A A G G，T C C A T G C C G T C C A C C T T G G A A G G 和CTTTTCCACCATCCAATGTATGG。以野生型和3個(gè)突變克隆基因組混池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過峰圖確定脫靶效應(yīng)。PCR擴(kuò)增引物如表2所示。

1.2.9 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 將各組細(xì)胞分別以2×103接種至96孔板，分別于貼壁后0、24、48、72 h加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng) 1 h（37℃，5% CO2），酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度。每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x-±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas9表達(dá)載體和SSA-RPG報(bào)告載體的構(gòu)建

將構(gòu)建的CRISPR/Cas9表達(dá)載體α-ENaC.CRISPR/Cas9和SSA-RPG報(bào)告載體α-ENaC.SSARPG進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示靶向α-ENaC基因的gRNA已經(jīng)插入到CRISPR/Cas9表達(dá)載體，靶位點(diǎn)序列已經(jīng)插入到SSA-RPG報(bào)告載體，測(cè)序結(jié)果見圖3。

表2 擴(kuò)增潛在脫靶位點(diǎn)所需引物序列

圖3 α-ENaC.CRISPR/Cas9和α-ENaC.SSA-RPG報(bào)告載體的測(cè)序圖

2.2 三組CRISPR/Cas9表達(dá)載體在HEK293T細(xì)胞的活性檢測(cè)

為了驗(yàn)證3組CRISPR/Cas9 表達(dá)載體的活性大小，在HEK293T 細(xì)胞中對(duì)3組CRISPR/Cas9 表達(dá)載體利用SSA-RPG報(bào)告載體進(jìn)行了活性檢測(cè)。將3組α-ENaC.CRISPR/Cas9和α-ENaC.SSA-RPG 報(bào)告載體分別共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后在熒光顯微鏡下觀察熒光，同時(shí)用流式細(xì)胞儀對(duì)DsRed+GFP+和DsRed+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h 后，a、b、c三組細(xì)胞都既發(fā)紅色熒光又發(fā)綠色熒光（圖4-A），流式細(xì)胞儀檢測(cè)c組的DsRed+GFP+/DsRed+的比率較高（圖4-B），說明該組中α-ENaC.CRISPR/Cas9-3相比其他兩組表達(dá)載體效率更高。因此后續(xù)的L2細(xì)胞的α-ENaC基因的敲除實(shí)驗(yàn)我們采用α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達(dá)載體。

2.3 α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達(dá)載體在L2細(xì)胞的活性檢測(cè)

為了檢測(cè)構(gòu)建的α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達(dá)載體在L2細(xì)胞是否具有活性，將α-ENaC.CRISPR/Cas9-3和α-ENaC.SSA-RPG-3共轉(zhuǎn)染L2細(xì)胞，將野生型的Cas9-Wild和α-ENaC.SSA-RPG-3共轉(zhuǎn)染作為對(duì)照，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞（圖5）。從圖中可以看出，轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)照組細(xì)胞只發(fā)紅光不發(fā)綠光，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞既發(fā)紅光又發(fā)綠光，說明構(gòu)建的α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達(dá)載體具有活性，在報(bào)告載體水平可以有效的切割靶位點(diǎn)。

2.4 蛋白檢測(cè)

挑取嘌呤霉素篩選后的8個(gè)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)，克隆4#和7#細(xì)胞株中α-ENaC蛋白表達(dá)量顯著下降，克隆8#細(xì)胞株α-ENaC蛋白完全沒有表達(dá)（圖6）。

2.5 基因序列突變檢測(cè)

提取單克隆的4#、7#和8#的基因組DNA，并PCR擴(kuò)增靶位點(diǎn)附近序列，測(cè)序結(jié)果顯示為雜峰，進(jìn)一步將PCR產(chǎn)物克隆到pMDTM19-T載體中進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，克隆4#和7#中細(xì)胞均為單等位基因突變，分別缺失4 bp和2 bp且都是移碼突變，克隆8#為雙等位基因突變，分別為插入1 bp的移碼突變和186 bp的大片段缺失（圖7）。

圖4 HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h的CRISPR/Cas9系統(tǒng)活性檢測(cè)

圖5 L2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h的CRISPR/Cas9系統(tǒng)活性檢測(cè)

圖6 Western Blotting檢測(cè)α-ENaC蛋白表達(dá)

2.6 脫靶檢測(cè)

為了檢測(cè)該CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，選擇了4個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增后測(cè)序，通過峰圖確定脫靶效應(yīng)，結(jié)果（圖8）顯示4個(gè)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果都為單峰，并與NCBI公布的序列結(jié)果一致，說明4個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)沒有發(fā)生脫靶現(xiàn)象。

圖7 突變株靶位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

圖8 潛在脫靶位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

2.7 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

為了探討α-ENaC蛋白的表達(dá)對(duì)L2細(xì)胞株增殖的影響，采用CCK-8對(duì)細(xì)胞增殖活力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果（圖9）顯示，同一時(shí)點(diǎn)，α-ENaC基因敲除的細(xì)胞株增殖活力較野生型細(xì)胞均顯著降低（P＜0.01），48 h和72 h時(shí)，雙等位基因突變株增殖活力下降較單等位基因突變株更為顯著（P＜0.01）。

圖9 細(xì)胞增殖試驗(yàn)（*P＜0.01）

3 討論

α-ENaC蛋白是ENaC通道的功能亞基，其主要功能是調(diào)節(jié)極化上皮細(xì)胞的水鹽平衡，在肺水腫液的清除過程中必不可少［17］；此外，α-ENaC蛋白還可能參與精子活力的調(diào)控［11］。研究發(fā)現(xiàn)，α-ENaC蛋白在HepG2細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞中，還可能通過調(diào)控Na+電流對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響［9-10］，因此推測(cè)α-ENaC蛋白可能與肺泡上皮細(xì)胞的增殖有關(guān)。由于α-ENaC基因敲除的小鼠出生后肺內(nèi)羊水不能及時(shí)排出，最多只能存活40 h［6］，該模型不能對(duì)α-ENaC蛋白的功能做進(jìn)一步的研究。II型肺泡上皮細(xì)胞是肺泡上皮細(xì)胞的干細(xì)胞［13］，其增殖能力在肺損傷修復(fù)時(shí)具有重要的功能。因此，研究α-ENaC蛋白在II型肺泡上皮細(xì)胞中的功能具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合SSA-RPG報(bào)告載體篩選系統(tǒng)，成功構(gòu)建α-ENaC基因敲除的細(xì)胞株。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的基因編輯系統(tǒng)，因其成本低、構(gòu)建簡(jiǎn)單、打靶效率高受到了科研工作者的青睞，在許多物種及細(xì)胞上都有應(yīng)用。但是關(guān)于在大鼠II型肺泡上皮細(xì)胞上的應(yīng)用，還未見報(bào)道。SSA-RPG報(bào)告載體是一種富集基因編輯的陽性細(xì)胞的篩選報(bào)告系統(tǒng)［16］，已應(yīng)用于人、小鼠、雞、豬等多種細(xì)胞［16，18-20］。該系統(tǒng)不僅可以通過嘌呤霉素或流式細(xì)胞儀對(duì)基因編輯的陽性細(xì)胞進(jìn)行富集，還可以通過轉(zhuǎn)染后48 h的熒光來檢測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的活性。實(shí)驗(yàn)中我們選取了靶向大鼠L2細(xì)胞α-ENaC基因的3個(gè)靶位點(diǎn)，分別構(gòu)建了3組CRISPR/Cas9表達(dá)載體和相應(yīng)的SSA-RPG報(bào)告載體。但是由于大鼠L2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低，因此我們首先在HKE293T上首先進(jìn)行了CRISPR/Cas9系統(tǒng)活性的檢測(cè)，確定以切割活性較大的α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達(dá)載體在L2細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得2株單等位基因突變細(xì)胞株和一株雙等位基因突變細(xì)胞株，這些突變?cè)斐梢拼a突變或是大片段的缺失。CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然當(dāng)前在動(dòng)植物中得到了廣泛的應(yīng)用，但是脫靶效應(yīng)一直是CRISPR/Cas9系統(tǒng)困擾科研工作者的一個(gè)重要的問題。大鼠ENaC家族由α、β和γ族3個(gè)高度同源的亞單位組成［21］，因此我們根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)理，同時(shí)結(jié)合α-ENaC基因的特點(diǎn)，選擇含有NGG序列的潛在的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)，沒有檢測(cè)到脫靶現(xiàn)象，下一步我們將通過全基因組測(cè)序?qū)γ摪袉栴}做進(jìn)一步分析。對(duì)敲除細(xì)胞株進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果顯示單等位基因突變細(xì)胞株蛋白表達(dá)明顯降低，而雙等位基因突變細(xì)胞株蛋白完全沒有表達(dá)，因此我們成功構(gòu)建了α-ENaC基因敲除的大鼠L2細(xì)胞株。對(duì)α-ENaC基因敲除前后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖活力檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-ENaC基因敲除后，L2細(xì)胞的增殖活力顯著降低，證明α-ENaC蛋白表達(dá)與細(xì)胞增殖有關(guān)，這與之前的相關(guān)報(bào)道一致［9-10］。由此可見，α-ENaC蛋白表達(dá)對(duì)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的增殖具有重要意義。因此，α-ENaC基因敲除細(xì)胞株的構(gòu)建，為進(jìn)一步闡明α-ENaC對(duì)L2細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制及其它功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合SSA-RPG報(bào)告載體系統(tǒng)靶向敲除L2細(xì)胞α-ENaC基因，通過嘌呤霉素篩選獲得基因敲除的細(xì)胞株。對(duì)基因敲除細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，基因敲除細(xì)胞株的增殖活力顯著降低，其中雙等位基因突變的細(xì)胞株增殖活力下降更為顯著。

致謝

感謝吉宏龍教授在本實(shí)驗(yàn)和論文修改中給予的建議。