陳敏潔 唐桂月 洪香娜 郝沛 江靜 李軒

（1. 中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越中心合成生物學(xué)重點實驗室，上海 200032；2. 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所病原發(fā)現(xiàn)與大數(shù)據(jù)中心，上海 200000；3. 河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院棉花生物學(xué)國家重點實驗室植物逆境生物學(xué)重點實驗室，開封 475004）

RNA作為一種重要的生物大分子，參與細(xì)胞生命代謝的整個過程，其代謝異常會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生［1］。故了解RNA的功能和代謝對于人類健康至關(guān)重要。目前，靶向DNA的技術(shù)如鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）、CRISPR-Cas9 或 Cas12 等［2］現(xiàn)已成為生物醫(yī)學(xué)實驗室的常規(guī)操作，并且已經(jīng)初步應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。然而DNA序列一旦干預(yù)成功，在很大程度上會遺傳給后代，具有永久性與不可恢復(fù)性。與相對穩(wěn)定遺傳的DNA不同，RNA引起的改變是暫時、非永久性的。但是RNA生物學(xué)的極度復(fù)雜性導(dǎo)致很難精確地靶向、跟蹤或編輯。目前靶向RNA的技術(shù)主要包括RNAi、MS2技術(shù)、ADARs技術(shù)及CRISPR-Cas13 技術(shù)等［3］。

本文主要對目前最新的靶向RNA技術(shù)的CRISPR-Cas13家族的分類及防御機(jī)制進(jìn)行綜述，介紹了 CRISPR-Cas13 技術(shù)的應(yīng)用以及基于CRISPRCas13家族的RNA編輯系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展，并對目前CRISPR-Cas13 RNA編輯技術(shù)體系存在的問題進(jìn)行分析和對未來的發(fā)展進(jìn)行展望。

1 CRISPR-Cas13家族和分類

CRISPR-Cas13是基于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的RNA靶向和編輯系統(tǒng)，可保護(hù)其免受病毒侵襲。該系統(tǒng)類似于CRISPR-Cas9系統(tǒng)，但與靶向DNA的Cas9不同，Cas13蛋白僅靶向切割單鏈RNA。CRISPRCas13（以前稱為 C2c2）［4］是 CRISPR-Cas系統(tǒng)中的第二大類第VI型，是家族中目前發(fā)現(xiàn)的唯一只靶向ssRNA的系統(tǒng)。它包含單一的效應(yīng)蛋白質(zhì)Cas13，與 CRISPR RNA（crRNA）組裝時形成一個由crRNA引導(dǎo)的RNA靶向效應(yīng)復(fù)合物。迄今為止研究的所有Cas13蛋白都具有兩種不同的核糖核酸酶活性［5］，一種是RNase負(fù)責(zé)pre-crRNA的預(yù)處理形成成熟的VI型干擾復(fù)合物［6］；而另一種RNase 活性由兩個較高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合（Higher eukaryotes and prokaryotes nuceotide-binding，HEPN）結(jié)構(gòu)域提供，是target-RNA 在病毒干擾過程中降解所必需的，研究證明這兩個HEPN結(jié)構(gòu)域中的單點突變會完全消除 RNA 的切割［4，7-8］。HEPN 結(jié)構(gòu)域能夠幫助切割 ssRNA，但不能切割 dsRNA、ssDNA或 dsDNA，且當(dāng)RNA 靶中存在折疊結(jié)構(gòu)時，Cas13優(yōu)先在非堿基配對的 ssRNA 區(qū)域進(jìn)行剪切［9］。

圖1 CRISPR-Cas13家族分類圖

目前CRISPR-Cas13根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育可分為4個亞型（A、B1、B2、C 和 D）［6，10］（圖 1）。同源序列分析表明Cas13四個亞型具有低同源性，且同源序列僅限于HEPN結(jié)構(gòu)域位點。HEPN結(jié)構(gòu)域可以存在于Cas13不同位置，在VI-B型基因座中還存在其它特征，VI-B1系統(tǒng)具有額外的ORF，CSX28，其編碼具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域（或可能是信號肽）和一個HEPN結(jié)構(gòu)域的小蛋白質(zhì)。然而，VI-B2系統(tǒng)在許多情況下（但并非所有）存在不同的ORF，Csx 27，也編碼一個小蛋白質(zhì)，似乎包含3-4個預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域，從而進(jìn)一步被劃分為B1和B2亞型［11］。最新發(fā)現(xiàn)的亞型VI-D和相關(guān)的效應(yīng)蛋白 Cas13d，它們主要存在于Eubacterium和Ruminococcus兩種細(xì)菌中［6，11］。VI-D亞型比以前發(fā)現(xiàn)的所有亞型都小得多（比先前鑒定的Cas13蛋白小約26%）［6］。此外，與VI-B系統(tǒng)一樣，絕大多數(shù)VI-D系統(tǒng)都含有相關(guān)的輔助蛋白，這些蛋白質(zhì)都含有WYL結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域通常與原核防御系統(tǒng)有關(guān)［12］。除了系統(tǒng)發(fā)育特征外，亞型之間的功能也存在差異。例如，Seletsky等［13］對11個Cas13a 同系物的pre-crRNA 處理行為進(jìn)行的研究。

2 CRISPR-Cas13家族防御的分子機(jī)制

CRISPR-Cas13系統(tǒng)的防御過程與其他CRISPRCas系統(tǒng)相似，包括 3 個階段：第一是新間隔序列的獲?。?4］，稱適應(yīng)階段；第二是 crRNA的合成［15］，即 CRISPR基因座的表達(dá)；第三是對外來核酸的抵御，稱干擾階段［16］（圖2）。適應(yīng)階段獲取外源核酸序列整合在CRISPR陣列中。CRISPR陣列包括交替的半回文直接重復(fù)序列和由整合酶Cas蛋白插入的外源核酸“間隔”序列組成。一直以來Cas1、Cas2被認(rèn)為是參與新間隔獲取的主要功能蛋白［17］，然而在一些情況下，VI型CRISPR-Cas缺乏適應(yīng)基因（Cas1、Cas2）［11］，表明它們可能利用同一基因組中其他 CRISPR-Cas基因座的適應(yīng)模塊，或者失去了它們的適應(yīng)模塊，不再積極地獲得新的間隔［18］。

圖2 CRISPR-Cas13家族分子防御過程

CRISPR基因座表達(dá)起始產(chǎn)物pre-crRNA，經(jīng)過相關(guān)Cas 蛋白和RNA 核酸酶的加工形成成熟crRNA，此過程即為 CRISPR 基因座的表達(dá)［13，19］。研究表明，VI型crRNA處理是由Cas13中的一種專用RNA核酸酶進(jìn)行的。East-Seletsky等［5］首先證明Cas13a具有pre-crRNA加工活性，并且該活性不需要HEPN核酸酶結(jié)構(gòu)域。Cas13b和Cas13d也被證明具有pre-crRNA處理活性，在Cas13b的系統(tǒng)中，pre-crRNA被加工成一個66 nt的成熟crRNA（一個30 nt的5' -間隔和一個36 nt的3'-直接重復(fù)序列）［11］。而Cas13d pre-RNA加工產(chǎn)生的成熟crRNA具有與Cas13a家族相似的重復(fù)間隔結(jié)構(gòu)［6］。鑒于在 VI-A、B和D型系統(tǒng)中pre-crRNA處理的保守性，Cas13c也很可能保持切割pre-crRNA的能力，但還需要進(jìn)一步研究證實。

成熟的crRNA能夠招募Cas13蛋白，從而完成防御入侵最重要的一步干擾階段，準(zhǔn)確識別外源核酸并對其進(jìn)行精準(zhǔn)剪切。CRISPR-Cas13的4個亞型中，形成的crRNA結(jié)構(gòu)存在一定的差別。在Cas13a：crRNA復(fù)合物中，直接重復(fù)序列形成5-6個Watson-Crick堿基對的莖，由保守的2nt凸起（AC或AA）破壞，依賴于Cas13a一個7-9nt的莖環(huán)區(qū)域［9］。雖然目前還沒有高分辨率的VI-B型crRNA結(jié)構(gòu)，但RNA二級結(jié)構(gòu)分析表明，與VI-A、VI-C和VI-D crRNA相比，VI-B crRNAs具有更長的直接重復(fù)序列莖（總共9-14 bp），通常具有幾個不成對的區(qū)域和凸起，因此莖環(huán)更?。?0］。除莖環(huán)結(jié)構(gòu)之外，在 VI-B 型系統(tǒng)中，直接重復(fù)序列相對于間隔的順序也不同，直接重復(fù)序列的莖環(huán)位于間隔的3'處，而在VI-A、VI-C和VI-D系統(tǒng)中觀察到的直接重復(fù)序列在間隔的5'處結(jié)構(gòu)不同。與VI-A型和VI-B型crRNA 相比，VI-C型crRNAs直接重復(fù)序列的長度較短（～30 nt）［21］，表明它在存在不同的適應(yīng)模塊時可能與VI-A、B和D系統(tǒng)共同進(jìn)化。最后VI-D型，包含具有36 nt 直接重復(fù)序列的crRNA，形成了一個保守的8-10 nt莖，帶有一個4-6 nt的環(huán)，一個5-10 nt的5'側(cè)翼單鏈區(qū)（在pre-crRNA中）和一個包含保守的末端AAAAC基序的5-7 nt的3'側(cè)翼單鏈區(qū)［6，12］。

Cas13：crRNA核酸靶向復(fù)合物與靶標(biāo)核酸序列堿基互補(bǔ)幫助完成搜索過程和初始雜交。除此之外，如Cas9干擾復(fù)合物需要檢測dsDNA靶位點側(cè)翼的原間隔子相鄰基序（PAM）序列的存在也會幫助識別靶標(biāo)序列［22-23］。然而，Abudayyeh等［4］探索了Cas13a對于在每個crRNA靶位點側(cè)翼的核苷酸是否表現(xiàn)出相同的序列偏好。他們發(fā)現(xiàn)對于LshCas13a，protospacer-3'側(cè)翼的第一個核苷酸表現(xiàn)出對A、U或C（H）而不是G的偏好性。通過體外RNA降解實驗證實了該結(jié)果，結(jié)果表明該位置存在G核苷酸會顯著降低HEPN核酸酶的活性，而A、U和C會導(dǎo)致最大活性［24］。為了避免與PAM在“自我”CRISPR基因組學(xué)中所定義混淆，作者決定將這一序列偏好稱為“Protospacer flanking site”（PFS），而不是“Protospacer adjacent motif”（PAM）。自從首次報道PFS 偏好LshCas13a 以來，PFS 偏好也被證實存在于其他幾種 Cas13酶中。使用體外裂解試驗，最初證明LwaCas13a具有輕微的“ H” PFS偏好［25］。此作者后來又證明，當(dāng)對細(xì)菌篩選［26］或人類細(xì)胞系質(zhì)粒文庫篩選［20］PFS時，LwaCas13a不會表現(xiàn)出任何可檢測到的PFS偏好，并且靶向人細(xì)胞中含ssRNA的G-PFS不會導(dǎo)致任何缺陷定位效率。

Cas13b酶的PFS要求也有所不同。在細(xì)菌中對于來自Bergeyella zoohelcum和Prevotella buccae菌的兩個不同的Cas13b靶標(biāo)文庫篩選時，D（A、U或G）5'PFS和NAN或NNA 3'PFS是實現(xiàn)最佳RNA靶向所必需的［11］。相反，當(dāng)對來自PspCas13b進(jìn)行細(xì)菌中錯配的目標(biāo)文庫實驗時發(fā)現(xiàn)，有效的靶標(biāo)RNA裂解不需要優(yōu)選的PFS［20］。與Cas13a或Cas13b相反，對于迄今為止研究的任何Cas13d直系同源物，使用細(xì)菌篩選策略均未檢測到PFS序列。目前，關(guān)于Cas13c酶家族是否存在PFS偏好尚無定論。

3 CRISPR-Cas13分子技術(shù)的應(yīng)用

目前利用CRISPR-Cas13系統(tǒng)可對RNA進(jìn)行編輯、敲除、檢測、追蹤及成像等［3］。Cas13a是第一個被用于靶向RNA切割的效應(yīng)蛋白。Abudayyeh等［4］通過異源表達(dá)的Cas13a可以保護(hù)大腸桿菌免受MS2噬菌體的侵入，并首次在大腸桿菌中實現(xiàn)RNA敲除。作者通過改用Leptotrichia wadei（Lwa）來源的Cas13a實現(xiàn)了在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行RNA敲除［26］。基于Cas13a的RNA敲除系統(tǒng)與傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)相比，RNA敲除能力相當(dāng)?shù)獵as13a脫靶率低且可以靶向細(xì)胞核內(nèi)RNA。Cas13a的RNA敲除技術(shù)目前已經(jīng)被應(yīng)用到許多領(lǐng)域，如植物病毒敲除—蕪菁花葉病毒（TuMV，一種RNA病毒）［27-28］，馬鈴薯Y病毒（PVY）等［29］；哺乳動物細(xì)胞的單鏈RNA病毒敲除—淋巴細(xì)胞性腦膜炎病毒（LCMV），甲型流感病毒（IAV），水泡性口炎病毒（VSV）等［30］，癌癥相關(guān)的突變基因敲除，如KRAS等［31］。Cas13a被激活后附帶的非特異性RNA酶切活性目前還被應(yīng)用于核酸快速檢測，如 Gootenberg等［25，32-34］開發(fā)的一種 “SHERLOCK”檢測系統(tǒng)可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)從患者體液樣品中進(jìn)行無儀器的病毒的檢測。此外，Abudayyeh等［26］將生物素與dLwaCas13a融合的用于RNA免疫沉淀，通過將dLwaCas13a與負(fù)反饋（NF）系統(tǒng)結(jié)合使用，還可用于RNA成像的dLwaCas13a-NF系統(tǒng)。

Cas13d作為目前已知最短的Cas13蛋白，使其成為進(jìn)一步開發(fā)靶向RNA 工具的潛在平臺［6，12，35］。Yan 等［12］與 Konermann 等［6］將不同的 Cas13d 與不同的融合標(biāo)簽組合，實現(xiàn)在人細(xì)胞中的RNA敲除。此外，Cas13d目前還被應(yīng)用于活細(xì)胞RNA成像［36］。Cas13d平均大小為930 aa，是哺乳動物細(xì)胞中表征的最小的2類CRISPR效應(yīng)子，這使得Cas13d結(jié)構(gòu)域可以與編碼多個gRNA的CRISPR陣列配對。同時，Cas13d基因組長度符合慢病毒遞送載體的包裝尺寸，Cas13d-慢病毒載體將成為原代細(xì)胞和體內(nèi)遞送的有力工具。

4 基于CRISPR-Cas13的RNA堿基精確編輯系統(tǒng)

4.1 基于CRISPR-Cas13的RNA堿基A＞I精準(zhǔn)編輯系統(tǒng)

靶向RNA編輯作為最新的研究方法，其不可永久性遺傳為治療某些遺傳性疾病提供一種更安全，更有效的替代方法。Cox等［20］將VI型CRISPRCas系統(tǒng)中無催化活性的dPspCas13b與ADAR2融合 的 REPAIR（RNA Editing for Programmable A-to-I Replacement）RNA堿基編輯系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中成功編輯與疾病相關(guān)的基因。REPAIR系統(tǒng)利用dcas13b指導(dǎo)ADAR2定點編輯最重要的兩個部分：具有催化活性增強(qiáng)的突變體ADAR2dd；特異性識別目標(biāo)A·C錯配堿基。ADAR2是一種廣泛存在于哺乳動物之中的腺苷脫氨酶，可對特異性的雙鏈RNA進(jìn)行A（腺苷）＞I（肌苷）脫氨，肌苷被當(dāng)成鳥嘌呤，并與胞嘧啶配對，從而實現(xiàn)堿基A＞G的轉(zhuǎn)變［37-38］。REPAIR系統(tǒng)目前主要分為兩個版本。REPAIRv1系統(tǒng)對靶序列具有較好的兼容性，在靶向熒光素Gluc RNA時，對靶目標(biāo)16種可能的基序都檢測到編輯。REPAIRv1系統(tǒng)靶向Gluc的編輯效率可達(dá)89%，具有較高的編輯效率，但在靶向內(nèi)源基因PPIB編輯率只有28%。為此作者在Cas13b與ADAR2之間加上一個多肽，結(jié)果REPAIRv1系統(tǒng)編輯效率提高，說明Cas13與ADAR2之間的連接多肽在改善系統(tǒng)編輯率中起到一定的作用。REPAIRv1系統(tǒng)相比于其他傳統(tǒng)RNA編輯技術(shù)—以ADAR2原始底物的編輯系統(tǒng)（如 BoxB- ADAR2［39］、全長 ADAR2［40］）編輯率高，但最近報導(dǎo)的以ADAR2原始底物的最新編輯系統(tǒng)的編輯率與REPAIRv1相當(dāng)［41］。相比脫靶率，轉(zhuǎn)錄組測序顯示REPAIRv1的脫靶編輯率與BoxB-ADAR相當(dāng)，但大于全長ADAR2的脫靶率，且脫靶位點主要集中在ADAR2原始底物結(jié)構(gòu)基序部分。REPAIRv1脫靶效應(yīng)主要是由于ADAR2的底物偏好性以及ADAR2dd的過度表達(dá)而引起。為了提高REPAIR的特異性，Cox等［20］通過在ADAR2上引入新突變（ADAR2 DD -E488Q-T375G）形成REPAIRv2系統(tǒng)，該系統(tǒng)在靶向Gluc其脫靶率低于REPAIRv1系統(tǒng)的約900倍，但編輯率也隨之降低（表1）。

表1 基于CRISPR-Cas13的RNA編輯系統(tǒng)編輯率與脫靶率

此外，本課題組利用無活性的dCas13a與ADAR2融合實現(xiàn)在酵母中的定點編輯［42］（圖3）。利用結(jié)合特異序列單鏈RNA能力的Cas13a，首次在模式生物裂殖酵母（S. pombe）中實現(xiàn)了靶向內(nèi)源RNA和降解靶標(biāo)RNA的功能。進(jìn)一步，再利用喪失RNA切割活性的突變dCas13a與人源的RNA腺嘌呤脫氨酶催化結(jié)構(gòu)域（hADAR2d）融合，引入到裂殖酵母中；再通過設(shè)計指導(dǎo)RNA，實現(xiàn)了對內(nèi)源RNA的精確定點編輯。對RNA定點編輯系統(tǒng)的參數(shù)（編輯堿基位置、距離、指導(dǎo)RNA結(jié)構(gòu)和長度等）進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的編輯系統(tǒng)對內(nèi)源靶標(biāo)RNA的編輯效率達(dá)到了59%。

圖3 dCas13a與dCas13b介導(dǎo)的RNA堿基編輯系統(tǒng)的比較［42］

4.2 基于CRISPR-Cas13的RNA堿基C＞U精準(zhǔn)編輯系統(tǒng)

Abudayyeh等［43］最近發(fā)表的一篇關(guān)于對RNA實現(xiàn)胞苷（C）＞尿苷（U）的精確編輯系統(tǒng)RESCUE（RNA Editing for Specific C-to-U Exchange），擴(kuò)展RNA編輯的功能，擴(kuò)大了可解決的疾病突變和蛋白質(zhì)修飾的范圍。

RESCUE系統(tǒng)利用無催化活性的靶向RNA的CRISPR-Cas13b（dCas13b）與改造后具有 C＞U 的ADAR2的腺嘌呤脫氨酶域融合而成。ADAR2具有天然A＞I脫氨活性，作者根據(jù)ADAR2與底物結(jié)合的結(jié)構(gòu)初步突變了與底物結(jié)合的3個關(guān)鍵位點（V351G、S486A、T375S）使其具有C＞U的脫氨作用，并在酵母中靶向外源基因Gluc具有15%的編輯率，作者在此基礎(chǔ)之上又經(jīng)過16輪突變篩選獲得具有較高編輯效率的RESCUE16系統(tǒng)。RESCUE系統(tǒng)在靶向16種Gluc的靶基序均具有編輯，并且gRNA spacer具有C或U錯配時具有較高的編輯率。RESCUE在靶向HEK293細(xì)胞內(nèi)源基因時，編輯最高能達(dá)到42%左右，其偏好性主要集中在5' U或A且受U或者 A 錯配位置影響。此外，作者還在體外證明了該系統(tǒng)對DNA、sRNA沒有胞苷脫氨作用。為了證明該系統(tǒng)可應(yīng)用于治療作用，作者利用RESCUE系統(tǒng)調(diào)節(jié)STAT和WNT-β-catenin信號通路。將具有RESCUE質(zhì)粒和gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），通過靶向 β-catenin上CTNNB1的已知磷酸化殘基，其編輯率最高可達(dá)28%，而被激活WNT-β-catenin信號傳導(dǎo)最高可以提高到5倍。

改造后的ADAR2仍具有A＞I的活性，Cas13b能夠?qū)re-crRNA加工形成A＞I/C＞I的gRNA同時實現(xiàn)A＞I和C＞U的編輯。作者通過優(yōu)化gRNA，可同時靶向HEK293FT細(xì)胞中CTNNB1A＞I和C＞U的編輯。RESCUE在靶向Gluc引起A＞I脫靶位點有1695個，C＞U脫靶位點具有188個。為此作者又通過引進(jìn)新的突變體，并發(fā)現(xiàn)S375A、S375C、S375N、N473I的引起脫靶率大幅度下降，其中S375A A＞I脫靶率降到139，C＞U 脫靶率降到103且編輯率沒有太大影響。

RNA編輯的一個主要優(yōu)點是它的可逆性，相比之下，DNA水平上的變化是永久性的。RESCUE能夠被gRNA引導(dǎo)至目標(biāo)RNA，實現(xiàn)C＞U編輯。該系統(tǒng)不僅擴(kuò)大了RNA編輯系統(tǒng)的范圍，并為RNA編輯技術(shù)的潛在臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［44］，同時利用RESCUE擴(kuò)展靶向能力意味著編輯新靶標(biāo)的到來，通過磷酸化、甲基化和糖基化等蛋白翻譯后修飾可以調(diào)節(jié)蛋白的活性和功能的位點如今都可作為編輯的新靶標(biāo)。但RESCUE仍具有較高的A＞I的RNA編輯活性，改造編輯酶或優(yōu)化其他參數(shù)系統(tǒng)減少脫靶率仍是目前需解決的問題。

5 展望

RNA是細(xì)胞中最重要的信使分子之一。RNA的功能和動態(tài)代謝的表征對于理解生命過程至關(guān)重要。然而RNA是快速合成、代謝使得在體內(nèi)很難靶向，跟蹤或編輯，CRISPR-Cas13系統(tǒng)為該領(lǐng)域提供了新的思路?；贑as13蛋白開發(fā)的RNA工具在疾病研究和臨床治療中的應(yīng)用將為人類醫(yī)療保健的巨大進(jìn)步作出貢獻(xiàn)。

截至目前，人類致病突變最多的一類是點突變（也稱為單核苷酸多態(tài)性）［47］。基于CRISPR的靶向DNA 的堿基編輯系統(tǒng)—CBEs（C＞U）、ABEs（A＞U）基本上能夠?qū)崿F(xiàn)4種堿基突變（C ＞T、A ＞ G、T＞C、G＞A）的修復(fù)，但靶向DNA具有可遺傳性和不可修復(fù)性等風(fēng)險。相反，RNA編輯系統(tǒng)可以從RNA水平上進(jìn)行修復(fù)而不會永久性地遺傳（表2）。目前基于CRISPR-Cas13家族的編輯系統(tǒng)A＞I（REPAIRv1）以及C＞U（RESCUE）基本上能修復(fù)致病突變的點突變。通過合理的設(shè)計方法，如gRNA的優(yōu)化以及編輯蛋白的定向進(jìn)化，可以進(jìn)一步提高系統(tǒng)的特異性和效率。盡管目前基于RNA堿基編輯系統(tǒng)的例子非常令人鼓舞，但是將大蛋白遞送到特定組織、體內(nèi)脫靶點突變的潛在生物學(xué)后果等相關(guān)工作依然具有挑戰(zhàn)性。因此，新型RNA堿基編輯器傳送系統(tǒng)的開發(fā)，包括針對特定組織的系統(tǒng)，可能是未來幾年的主要重點工作。