韓雪嬌 曾慶偉 趙玉萍

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，淮安 223003）

磷是植物生長發(fā)育所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，在植物的生長過程中起到重要作用［1］。然而，土壤中的

磷源往往以不溶性形態(tài)存在，植物無法吸收利用，土壤缺磷已成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要問題［2］。為改善土壤缺磷的情況，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷肥被大量施用，但磷肥中的有效磷成分（磷酸根陰離子）易與土壤中的Ca2+、Al3+、Fe3+等發(fā)生螯合作用而被固定，磷肥的利用率僅有10%-30%［3］。長期大量的磷肥施用還會破壞土壤生態(tài)，并最終造成土壤肥力下降，同時水體的富營養(yǎng)化也與磷肥的大量使用存在聯(lián)系［4］。解磷微生物是土壤中一類能夠溶解難溶性磷化合物，增加土壤可溶性磷含量的微生物［5］。研究表明接種解磷微生物能夠改善土壤營養(yǎng)條件，并有效促進植物的生長［6-7］。解磷微生物的開發(fā)和利用為解決土壤缺磷問題，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)化發(fā)展提供了新的思路。土壤中的解磷微生物種類繁多，包括細菌、真菌和放線菌等［8］。解磷細菌作為解磷微生物的重要組成部分，受到了學(xué)者的大量關(guān)注。

根據(jù)所溶解的難溶性磷源種類的不同，解磷微生物又被分為解無機磷微生物與解有機磷微生物［9］。許多研究表明，解無機磷微生物通過酸化、螯合、交換反應(yīng)和聚合物質(zhì)的形成等方式將不溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性形式，這可能與有機酸的產(chǎn)生、質(zhì)子（H+）的釋放、氧化還原活性金屬等有關(guān)。其中，低分子量有機酸的分泌是與解無機磷微生物的解磷能力密切相關(guān)［10］。

楊樹是蘇北的重要經(jīng)濟林木，具有成材快，易種植等優(yōu)勢，然而短期輪閥的經(jīng)營模式造成土壤肥力的大量流失，土壤缺磷問題已逐漸顯現(xiàn)［11］。本實驗室前期從楊樹根際篩選獲得了一株解無機磷細菌，初步篩選發(fā)現(xiàn)該菌株具有較強的解磷活性，然而該菌株的種屬、解磷能力及機理尚不清楚，因此本研究對該菌株進行種屬鑒定，測定其解磷能力，并對其解磷機理進行初步的探索和研究，以期為該菌株后期解磷菌劑開發(fā)和使用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 解無機磷細菌Mp1-Ha4分離自江蘇省淮安市清江浦區(qū)（東經(jīng)119°01'21"，北緯33°35'34"），現(xiàn)保存于淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院生物催化實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 國際植物研究所磷酸鹽生長培養(yǎng)基（National botanical research institute’s phosphate growth medium，NBRIP）：葡萄糖 10 g，磷酸鈣 5 g，MgCl 5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，（NH4）2SO40.1 g，去離子水1 L，pH7.0，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂粉。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH7.0，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂粉。

葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，K2HPO42 g，去離子水1 L，pH7.2-7.4。

淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉2 g，去離子水1 L，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 解無機磷細菌Mp1-Ha4的生物學(xué)特征 將-80℃保藏的解無機磷細菌Mp1-Ha4菌株劃線接種于LB平板，28℃培養(yǎng)活化2次。挑取活化后的菌株單菌落劃線接種于LB固體平板，28℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察單菌落的形狀、大小、表面光澤度和濕潤度等特征。同時將Mp1-Ha4菌株在LB固體平板上劃十字接種，并將無菌載玻片覆蓋于十字交叉位置，同樣條件下培養(yǎng)48 h后觀察菌株生長情況。挑取適量Mp1-Ha4菌體，進行革蘭氏染色，莢膜和鞭毛染色，并使用顯微鏡鏡檢觀察，同時進行KOH溶解性檢測，過氧化氫酶監(jiān)測，甲基紅（MR）檢測，伏普（VP）檢測和淀粉水解檢測，具體方法參照《微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》［12］。

1.2.2 解無機磷細菌Mp1-Ha4分子生物學(xué)鑒定 挑取上述活化后的菌株單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基，28℃，180 r/min培養(yǎng)12 h，即為種子液（OD600nm=0.806）。準確吸取1.5 mL菌液至2 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，去上清，無菌水洗滌菌體3次，使用基因組DNA提取試劑盒（DP302，TIANGEN）提取該菌株DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性，NanoDrop 2000c檢測核酸濃度及純度。以Mp1-Ha4菌株DNA為模板，細菌16S rDNA通用引物（27f：GATTTGATCCTGGCTCAG；1492r：TAGGCTCCTTGTTACTGACTT）為引物，進行該菌株16S rDNA擴增。PCR擴增體系（50 μL）：25 μL Taq Master Mix，上下游 引 物各 1 μL，DNA 模板 1 μL（100 ng），無菌水 22 μL ；擴增條件：94℃持續(xù) 3 min；94℃持續(xù) 45 s，54℃持續(xù) 45 s，72℃持續(xù)90 s，30個循環(huán)；72℃持續(xù)4 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，選取電泳條帶單一，片段大小合適的擴增樣品送至南京擎科生物公司進行測序。

16S rDNA測序結(jié)果在NCBI和Eztaxon server上進行序列比對。下載標準菌株的16S rDNA序列進行多序列同源性分析，并利用軟件MEGA7.0，采用Neighbour joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap method=1000）。

1.2.3 解無機磷細菌Mp1-Ha4對不同磷源的解磷能力 分別以磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵為唯一磷源配制NBRIP固體及液體培養(yǎng)基，取10 μL Mp1-Ha4種子液點接于上述3種磷源的NBRIP平板，28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每種磷源各設(shè)置3個重復(fù)。7 d后觀察測定溶磷圈與菌落直徑，并計算“溶磷圈直徑/菌落直徑”比值。取500 μL Mp1-Ha4種子液分別接種于含有上述3種磷源的50 mL NBRIP液體培養(yǎng)基，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)，每種磷源設(shè)置3個重復(fù)，以不接菌作為空白對照。培養(yǎng)72 h后，培養(yǎng)液10 000 r/min離心2 min，取上清，上清通過0.22μm濾膜過濾并收集濾液。采用鉬銻抗比色法［13］測定濾液可溶性磷含量，使用pH計測定培養(yǎng)基pH值，酸堿滴定法［14］測定濾液可滴定酸度。

1.2.4 解無機磷細菌Mp1-Ha4解磷動力學(xué) 將Mp1-Ha4種子液按1%的接種量接種于50 mL以磷酸鈣為唯一磷源的NBRIP液體培養(yǎng)基，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)9 d，每隔24 h取3組重復(fù)，以不接菌的空白培養(yǎng)基作為對照，按1.2.2的操作方法測定上清液的可溶性磷含量、pH值及可溶性磷含量。

1.2.5 有機酸的測定 取1.2.3中培養(yǎng)第7天的樣品，10 000 r/min離心10 min，取上清，上清通過0.22μm濾膜過濾，向濾液中按照濾液∶甲醇=1∶3的比例加入甲醇溶液，混勻，12 000 r/min離心1 min，取上清。采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）對上清中的葡萄糖酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸、丙二酸、酒石酸、草酸、馬來酸及檸檬酸含量進行測定色譜條件參照Zeng等［15］的測定條件。

2 結(jié)果

2.1 解無機磷細菌Mp1-Ha4的生物學(xué)特征

解無機磷細菌Mp1-Ha4的在LB平板上的菌落呈圓形，乳白色，邊緣整齊，表面濕潤光滑（圖1-A），為一株嚴格的好氧性細菌（圖1-B）。顯微鏡下觀察該菌株菌體為球形，直徑約0.8-1.0 μm。該菌株革蘭氏檢測結(jié)果為陰性，其他生理生化分析結(jié)果見表1。

圖1 菌株Mp1-Ha4的菌落形態(tài)和需氧性結(jié)果

表1 解無機磷細菌Mp1-Ha4生理生化分析結(jié)果

2.2 解無機磷細菌Mp1-Ha4的分子生物學(xué)鑒定

BLAST比對結(jié)果顯示Mp1-Ha4的16S rDNA與西地西菌（Cedeceasp.）（MK101024.1）具有較高的同源性，為100%。Eztaxon系統(tǒng)比對結(jié)果顯示該菌株的16S rDNA與西地西菌屬Cedeceasp.具有較高的同源性，為98.8%。根據(jù)16s rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，從圖中可以看出解無機磷細菌Mp1-Ha4與其他菌屬之間的進化關(guān)系，其中與Cedeceasp.（MK101024.1）的親緣關(guān)系最為接近。因此，將解無機磷細菌Mp1-Ha4鑒定為西地西菌（Cedeceasp.）。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的解無機磷細菌Mp1-Ha4系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 解無機磷細菌西地西菌（Cedecea sp.）Mp1-Ha4對不同磷源的解磷能力

平板實驗結(jié)果顯示，解無機磷細菌西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4能夠在以磷酸鈣、磷酸鋁和磷酸鐵為唯一磷源的NBRIP平板上生長，其在磷酸鈣平板上能夠產(chǎn)生明顯的溶磷圈（溶磷圈直徑/菌落直徑=1.33），而該菌株對磷酸鋁和磷酸鐵的溶解效果較差（圖3，表2）。在NBRIP液體培養(yǎng)基中，Mp1-Ha4菌株對磷酸鈣的解磷能力最強，達到了321.95 mg/L，顯著高于（P＜0.01）該菌株對磷酸鐵（17.07 mg/L）、磷酸鋁（30.46 mg/L）的解磷能力（圖 4）。

圖3 解無機磷細菌西地西菌（Cedecea sp.）Mp1-Ha4在不同磷源NBRIP平板上的生長及解磷情況情況

在對磷酸鈣的溶解過程中，培養(yǎng)基pH下降到了3.9，在對磷酸鋁、磷酸鐵溶解過程中，培養(yǎng)基pH分別下降到4.27和5.21。培養(yǎng)基pH與Mp1-Ha4菌株的解磷能力呈負相關(guān)（相關(guān)系數(shù)，R=-1.000）。對培養(yǎng)基可滴定酸度的測定結(jié)果顯示，Mp1-Ha4菌株對3種磷源溶解過程中，培養(yǎng)基可滴定酸度分別為2.10、0.22、0.15 mL，與該菌株的解磷能力呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)，R=1.000）。

表2 解無機磷細菌西地西菌（Cedecea sp.）Mp1-Ha4在不同磷源NBRIP平板上的解磷情況

圖4 解無機磷細菌西地西菌（Cedecea sp.）Mp1-Ha4對不同磷源的解磷能力

2.4 解無機磷細菌Mp1-Ha4解磷動力學(xué)

解無機磷細菌西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4對磷酸鈣表現(xiàn)出較強的解磷能力（圖5）。在培養(yǎng)的1-3 d內(nèi)，發(fā)酵液中可溶性磷含量增速較快，4-7 d內(nèi)，可溶性磷含量的增速較慢，并在第7天達到了最大值，其可溶性磷含量最大值為497.4 mg/L。隨著培養(yǎng)時間的增加，該菌株的解磷能力呈現(xiàn)出先增長再降低的趨勢。

隨著培養(yǎng)時間的變化，培養(yǎng)基pH與可滴定酸度也發(fā)生了明顯的變化（圖5）。在1-3 d內(nèi)，pH值從4.76降到了4.22，此后一直保持較平穩(wěn)的狀態(tài)，培養(yǎng)基pH與Mp1-Ha4菌株解磷量呈負相關(guān)（R=-0.812）。培養(yǎng)基可滴定酸度隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸增加，到第7天達到最大（3.53 mL），后緩慢下降，培養(yǎng)基可滴定酸度與Mp1-Ha4菌株解磷量呈正相關(guān)（R=0.911）。

圖5 解無機磷細菌西地西菌（Cedecea sp.）Mp1-Ha4對磷酸鈣的解磷動力學(xué)

2.5 有機酸的測定

HPLC檢測結(jié)果表明，解無機磷細菌西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4在對磷酸鈣溶解過程中能夠分泌大量的有機酸（表3），其中α-酮戊二酸、酒石酸和蘋果酸含量分別為858.12、627.11和99.36 mg/L，而草酸、檸檬酸、丙二酸、馬來酸和葡萄糖酸沒有被檢測到。這可能是發(fā)酵液pH下降的原因。

3 討論

為了獲得更加優(yōu)良的種質(zhì)資源，解磷微生物的分離、篩選工作仍在大量開展。已報道的解磷細菌種屬主要有節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、歐文式菌屬（Eerwinia）、沙門氏菌屬（Salmonelza）、固氮菌屬（Azotobacter）、泛菌屬（Pantoea）等［16-20］。本研究通過分子生物學(xué)鑒定Mp1-Ha4為西地西菌（Cedeceasp.），其對磷酸鈣的溶解能力達到了497.4 mg/L。Mónica等［21］從酸性土壤中分離得到解磷細菌，其解磷活性在100 mg/L-300 mg/L。葉維雁等［22］從番木瓜中分離得到一株解磷細菌PK-1，其對磷酸鈣的溶解能力為1.63 mg/L。王舒等［23］從油菜根際分離得到的解磷細菌的解磷能力在400 mg/L左右。由此可見，解磷菌株西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4為一株高效的解無機磷細菌。

表3 解無機磷細菌西地西菌（Cedecea sp.）Mp1-Ha4的有機酸分泌情況

分泌小分子量有機酸被認為是解無機磷細菌溶解難溶性磷酸鹽的主要機制［24］。解無機磷細菌西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4在對磷酸鈣溶解過程中，分泌了大量的有機酸，包括α-酮戊二酸、酒石酸和蘋果酸，總量達1 584.59 mg/L。張英等［25］研究發(fā)現(xiàn)，解磷微生物解磷過程中α-酮戊二酸、酒石酸與蘋果酸的量與溶磷量呈線性相關(guān)。劉勝亮等［26］在研究解磷微生物分泌有機酸與解磷量的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，酒石酸、草酸等有機酸的分泌與解磷量之間顯著相關(guān)。這3種有機酸的分泌可能在解無機磷細菌西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4解磷過程中發(fā)揮了重要作用。

研究表明，解磷細菌所分泌的有機酸在其解磷過程中充當(dāng)螯合劑或通過降低環(huán)境pH來溶解釋放不溶性磷酸鹽中的磷酸根離子［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，解無機磷細菌西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4解磷過程中，培養(yǎng)基pH與其解磷量呈顯著負相關(guān)，而培養(yǎng)基可滴定酸含量與其解磷量呈顯著正相關(guān)。趙為容［28］在對27株解磷細菌進行研究時發(fā)現(xiàn)，解磷菌株的解磷量與pH值之間呈負相關(guān)，本實驗結(jié)果與此研究結(jié)果表現(xiàn)一致。這些結(jié)果表明，分泌大量小分子有機酸，降低環(huán)境的pH可能是其溶解難溶性磷酸鹽的主要機制。

解無機磷細菌西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4對磷酸鈣具有較強的溶解能力，對磷酸鋁和磷酸鐵的溶解能力相對較弱，這與Pérez等［29］的研究結(jié)果相一致。一般中性、弱堿性土壤中的不溶性磷酸鹽以磷酸鈣為主，而酸性土壤則以磷酸鐵、磷酸鋁較多。我國北方地區(qū)土壤以中性、弱堿性偏多。長期的自然選擇使得北方土壤中分離獲得的解無機磷細菌西地西菌（Cedeceasp.）Mp1-Ha4對磷酸鈣有較好的溶解能力。這些結(jié)果表明，該菌株是一株優(yōu)良的生物菌肥資源菌株，具有在北方土壤中適地施菌的巨大潛力。本研究將為解無機磷細菌西地西菌Cedeceasp. Mp1-Ha4的種質(zhì)資源開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為該菌株后期的田間應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

通過生理生化分析和分子生物學(xué)方法確定解無機磷細菌Mp1-Ha4為西地西菌（Cedeceasp.），其對磷酸鈣具有較強的溶解能力，通過對有機酸種類及含量的測定初步判定分泌有機酸降低環(huán)境pH是其主要解磷機理。