許廣 王夢姣，2 鄧百萬，2 郭苗苗

（1. 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000；2. 陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，漢中 723000）

在植物根際土壤中，土壤-微生物-植物根際之間相互影響，相互作用［1］。根際微生物在土壤的物質(zhì)轉(zhuǎn)化［2］、促進(jìn)植物吸收養(yǎng)分［3］、提高植物抗病蟲害能力［4］、提高植物抗逆性［5］、生長發(fā)育等方面發(fā)揮著極其重要的作用，同時(shí)根際土壤微生物種類和數(shù)量也是評價(jià)土壤肥力高低的重要生物指標(biāo)。

根際土壤細(xì)菌代謝旺盛，繁殖速度快，是植物根際土壤微生物數(shù)量、種類較多的類群［6］，幾乎驅(qū)動(dòng)所有生物地球化學(xué)循環(huán)，參與土壤中養(yǎng)分轉(zhuǎn)化［7］。例如：熒光假單孢菌（Fluorescent pseudomonas）［8］作為生防菌抑制病原真菌生長、固氮細(xì)菌（Azotobacter）［9］能促進(jìn)對氮元素的吸收，伯克霍德氏菌（Burkholderia）［10］能溶解硅酸鹽礦物，減少環(huán)境污染等等。

近年來在植物土壤微生物多樣性方面研究很多，但是主要集中在農(nóng)作物［11-14］、林木［15］等方面，對茶樹根際土壤微生物的研究較少。本文選取漢中西鄉(xiāng)地區(qū)3種植茶年限的茶樹，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)研究其根際土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成，并分析茶樹土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落的相關(guān)性，為改善茶樹的土壤和提高茶樹產(chǎn)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣地位于秦巴山區(qū)腹地的漢中市西鄉(xiāng)縣千山茶園，屬北亞熱帶半濕潤季風(fēng)氣候，土壤類型為礦物質(zhì)含量較高的黃棕壤，茶樹其他自然生長條件見表1。自20世紀(jì)90年代以來，該地已經(jīng)建立茶葉生產(chǎn)基地，當(dāng)前已經(jīng)形成規(guī)模廣大、管理良好的現(xiàn)代化生態(tài)茶園。施肥上采用機(jī)械化方式施加有機(jī)肥，同時(shí)補(bǔ)充氮肥，葉面肥?；谏鷳B(tài)和綠色有機(jī)理念，茶樹種植方面均采用有機(jī)肥，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)施肥，減少人為干預(yù)。

研究對象選取該茶園種植年限為5年（32°56'2″ N，107°51' 32″ E，737 m）、10 年（32°56'14″N，107°51' 59″ E，805 m）、20 年（32°56' 58″ N，107°52' 13″ E，814 m）且品種均為紫陽群體的茶樹根際土壤。

采樣時(shí)間為2018年9月，天氣晴朗，用五點(diǎn)采樣法收集距茶樹主干20 cm，垂直深度20-40 cm的根際土壤。用抖落法去掉與根系結(jié)合松軟土壤，將剩余土壤與根系裝入無菌密封塑料袋中，貼上標(biāo)簽，立即帶回實(shí)驗(yàn)室混勻，過2 mm篩，一部分用于分子實(shí)驗(yàn)并保存于-80℃冰箱，一部分用于測定土壤理化性質(zhì)。

表1 茶樹生長環(huán)境基本情況

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法分析不同植茶年限茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性

1.2.1.1 根際細(xì)菌的分離計(jì)數(shù)及純培養(yǎng) 稱取10 g茶樹土壤依次制備成10-1、10-2、10-3梯度稀釋液。各吸取100 mL至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，涂布均勻，37℃培養(yǎng)14-18 h，重復(fù)3次，利用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

1.2.1.2 根際細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增及鑒定 用天根細(xì)菌試劑盒提取基因組DNA，用通用引物E-27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rDNA的序列擴(kuò)增。送天津擎科生物公司測序。將所測的序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中并進(jìn)行BLAST檢索，下載同源性較高的數(shù)據(jù)，初步確定分離得到菌的種屬。

1.2.1.3 根際細(xì)菌的種群多樣性分析 計(jì)算不同植茶年限茶樹根際土壤細(xì)菌的香儂-威納指數(shù)（Shannon-Wiener）、辛普森指數(shù)（Simpsonindex）、豐富度指數(shù)（Margalef index）、均勻度（Evenness），具體分析方法參考文獻(xiàn)［16-17］。

1.2.2 高通量測序分析不同植茶年限茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性

1.2.2.1 DNA提取、16S rDNA擴(kuò)增和高通量測序用Power SoilDNA Isolation Kit試劑盒提取土壤微生物總DNA，用Nano Drop分光光度計(jì)（Nano-100，Aosheng Instrument Co Ltd.）檢測DNA的濃度和純度。用 引 物 515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列的V3-V5區(qū)。PCR反應(yīng)體系為50 μL，2×Premix Taq 25 μL，515F/806R 引物各 1 μL，DNA 3 μL，Nuclease-free water 20 μL， 反 應(yīng) 條 件 ：94℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)（94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，30 s），72℃ 10 min，4℃ 保存。使用 Illumina Hiseq2500平臺進(jìn)行測序。

1.2.2.2 高通量測序數(shù)據(jù)處理 利用Trimmomatic軟件得到質(zhì)控后的PE reads。選擇FLASH軟件將其拼接為原始序列。然后利用Mothur軟件將序列分配至相應(yīng)的樣品中，得到最終片段。利用Usearch［18］軟件以97%的相似度將Tags聚類成為OTU，并計(jì)算Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、均一度，具體方法參考［19］。同時(shí)基于MRPP多相應(yīng)置換過程分析、Adonis置換多因素方差分析、Amova分子方差分析進(jìn)行差異檢驗(yàn)，從而獲取樣品多樣性和組間顯著性差異分析，具體方法參考［20］。

1.2.3 土壤理化性質(zhì)的測定 土壤有機(jī)碳（TOC）測定采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法，總氮（TN）測定采用凱氏定氮法，水解性氮（HN）測定采用堿解擴(kuò)散法?？偭祝═P）測定采用堿熔法，有效磷（AP）測定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法，全鉀（TK）測定采用堿熔法，速效鉀（AK）測定采用1 mol乙酸銨浸提法，pH計(jì)測定土壤pH，具體方法參考［21-22］。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)法結(jié)果分析

2.1.1 不同植茶年限茶樹根際土壤的細(xì)菌數(shù) 不同年限茶樹土壤細(xì)菌數(shù)目存在顯著性差異。5年茶樹的根際土壤細(xì)菌數(shù)量明顯高于10年和20年，細(xì)菌數(shù)目隨著植茶年限之間增加呈現(xiàn)下降趨勢（圖1）。

圖1 不同植茶年限的茶樹細(xì)菌菌落數(shù)

2.1.2 不同植茶年限茶樹根際土壤的細(xì)菌組成 對3種不同種植年限的茶樹根際土壤進(jìn)行16S rDNA測序和比對分析。結(jié)果表明，在門水平上，3種年限之間群落組成有較大差異，10年的茶樹土壤細(xì)菌門種類最多（圖2-A），厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢菌門，在5年、10年、20年茶樹土壤中所占比例均最大，分別為93.7%、77.5%、87.5%，；在屬水平上，芽孢桿菌屬（Bacillus）在3種年限中均為優(yōu)勢菌屬，比例分別是62.5%、75.5%、79.4%，不同年限之間細(xì)菌構(gòu)成和多樣性有顯著性差異，10年的茶樹土壤細(xì)菌多樣性最為豐富，5年生次之，20年生最低（圖 2-B）。

圖2 不同植茶年限下的茶樹根際細(xì)菌組成

2.1.3 不同植茶年限茶樹根際細(xì)菌的多樣性比較 利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對3種年限茶樹根際土壤樣品進(jìn)行分離純化，共獲得129株根際細(xì)菌，比較不同植茶年限的細(xì)菌多樣性。由表2可見，不同年限茶樹根際細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)，存在顯著差異（P＜0.05），5年、10年、20年茶樹細(xì)菌豐富度指數(shù)分別為1.54、2.31、0.58，說明10年茶樹細(xì)菌豐富度最高，5年次之，20年最低。Simpson指數(shù)分別是0.54、0.42、0.27；Shannon指數(shù)分別為1.56、1.54、0.77。5年和10年茶樹細(xì)菌Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)相似且均明顯高于20年茶樹，說明5年和10年茶樹細(xì)菌的多樣性更為豐富，20年茶樹土壤細(xì)菌多樣性最低。

表2 不同種植年限茶樹根際細(xì)菌的多樣性指數(shù)比較

2.2 高通量測序結(jié)果分析

2.2.1 不同植茶年限茶樹細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)差異性 利用高通量測序技術(shù)測得序列片段，使用QIIME軟件，基于97%的相似度將其聚類為OTU，共得到10 982條OTU。所有樣本Observed稀釋曲線趨于平緩，表明所測序列數(shù)據(jù)可以較好地反映細(xì)菌群落的種類與數(shù)量，基本涵蓋了樣本土壤的所有細(xì)菌種群，足以進(jìn)行下游數(shù)據(jù)分析（圖3-A）。

通過Chaol指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來比較3種植茶年限下的土壤細(xì)菌豐富度和多樣性。根據(jù)Chaol指數(shù)得出，5年生的茶樹根際細(xì)菌物種總數(shù)最多，10年茶樹次之，20年最少（表3）；根據(jù)Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)得出，3種年限的茶樹細(xì)菌均表現(xiàn)出高水平的物種豐富度和細(xì)菌多樣性，同時(shí)不同年限之間存在顯著性差異；10年生的茶樹細(xì)菌Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均最高，說明10年生的茶樹豐富度和多樣性均最高；20年生的茶樹根際細(xì)菌豐富度和細(xì)菌多樣性最低（圖3-BC）。對相對豐度較高（＞1%）的30個(gè)細(xì)菌菌群，在屬水平上進(jìn)行聚類熱圖分析（圖3-D）。結(jié)果表明，5年和20年茶樹細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成較為相似，與10年茶樹存在顯著性差異?；贛RPP、Anosim 和Adonis 算法的差異檢驗(yàn)結(jié)果（表4）也表明3種植茶年限的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

2.2.2 不同植茶年限茶樹土壤細(xì)菌群落組成差異性 3種年限的主要菌門（＞1%）共有16個(gè)（圖4-A），分別是奇古菌門（Thaumarchaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣 原 體（Chlamydiae）、 綠 菌 門（Chloroflexi）、Dependentiae、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、Latescibacteria、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、變形菌門（Proteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、Patescibacteria。主要菌屬（＞1%）共有17個(gè)（圖4-B），分別是ADurb.Bin063-1、酸桿菌屬（Acidibacter）、根 瘤 菌 屬（Bradyrhizobium）、Bryobacter、 伯 克氏 菌 屬（Burkholderia）、Candidatus_Solibacter、Candidatus_Udaeobacter、戴爾福特菌屬（Delftia）、Dysgonomonas、 芽 單 胞 菌（Gemmatimonas）、Granulicella、HSB_OF53-F07、Massilia、Mucilaginibacter、地桿菌屬（Pedobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）。

表3 不同種植年限的茶樹細(xì)菌多樣性比較

3種年限的茶樹土壤樣本各自特有OTU在各自總OTU數(shù)量中所占比例不同，分別為占5年茶樹（4 353）OTU數(shù)目的35.7%、占10年茶樹（3 782）OTU數(shù)目的26.0%、20年茶樹（2 847）OTU數(shù)目的20.3%。3種年限茶樹土壤公有OTU數(shù)為1 646個(gè)，分別占5年的37.8%、10年的43.5%、20年的57.8%（圖5）。該結(jié)果表明3種年限下的茶樹細(xì)菌群落組成存在顯著性差異。

2.2.3 不同植茶年限細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性 土壤理化性質(zhì)結(jié)果見表5，其中TOC、TN、TK、AP、AK和pH在3種年限茶樹土壤中呈現(xiàn)顯著性差異。10年茶樹土壤TOC含量最高，5年和20年茶樹TOC差異不明顯，但都低于10年茶樹；三者的TN含量差異性顯著，10年最高，5年次之，20年最低；5年和20年茶樹土壤之間TK含量差異不明顯且低于10年茶樹土壤；5年茶樹土壤的AP含量顯著高于10年和20年茶樹；AK在10年和20年茶樹土壤中含量幾乎一致且明顯高于5年茶樹土壤；20年茶樹土壤pH明顯高于5年和10年；基于茶樹細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子間CCA數(shù)據(jù)和相關(guān)性熱圖（圖6）分析：TN、TK、AP、pH對漢中茶樹細(xì)菌群落的影響較大。

圖3 不同植茶年限茶樹細(xì)菌豐富度及多樣性分析

3 討論

土壤是茶樹生長的載體，茶樹連續(xù)種植后，極易導(dǎo)致土壤酸化［23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明植茶年限的增加，根際土壤pH呈現(xiàn)下降趨勢，與5年茶樹相比，20年茶樹根際土壤pH下降了18.5%，可見茶樹連續(xù)種植會(huì)引起土壤酸化，與前人研究結(jié)果一致。土壤中細(xì)菌種類最多，數(shù)量最大。細(xì)菌喜中性偏堿的土壤環(huán)境，連作會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量的減少［24］，土壤貧瘠，自毒效應(yīng)增強(qiáng)，多樣性降低，病蟲害加?。?5-26］。本實(shí)驗(yàn)中兩種方法結(jié)果均表明隨著植茶年限的增加，茶樹根際細(xì)菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢，多樣性也嚴(yán)重降低，與前人研究結(jié)果一致。

表4 不同植茶年限茶樹土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

圖4 不同植茶年限根際細(xì)菌群落主要菌群相對豐度

圖5 不同年限茶樹土壤樣品OTU分布的Venn分析圖

表5 不同植茶年限和高產(chǎn)茶園土壤理化性質(zhì)及CCA數(shù)據(jù)分析

比較傳統(tǒng)培養(yǎng)法和現(xiàn)代高通量測序技術(shù)的結(jié)果可見，后者得到的微生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者。反映出土壤中存在許多不可培養(yǎng)的微生物［27］。兩種方法均表明植茶年限對細(xì)菌群落構(gòu)成有顯著性影響，但是兩種方法獲得的優(yōu)勢菌群有顯著差異，原因在于培養(yǎng)法分離細(xì)菌時(shí)僅采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其所含營養(yǎng)與土壤原始營養(yǎng)環(huán)境差異較大，使得對營養(yǎng)要求復(fù)雜、培養(yǎng)基偏好性、生長緩慢、貧營養(yǎng)型的微生物無法生長，僅利于某幾種微生物類群生長，使其成為平板上的優(yōu)勢類群［28］。其次，微生物培養(yǎng)再選擇過程中部分微生物的信號會(huì)放大，其他大量微生物信息可能缺失［29］。例如：黃祖新等［30］采用培養(yǎng)法與非培養(yǎng)法比較宿根甘蔗根際土壤細(xì)菌多樣性時(shí)，得到Burkholderia和Acidobacteria分別是培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法中的優(yōu)勢菌群；崔中利［31］采用培養(yǎng)法與非培養(yǎng)法比較高產(chǎn)水稻土細(xì)菌多樣性時(shí)，得出培養(yǎng)法優(yōu)勢菌為Pseudomonas和Bacillus與非培養(yǎng)法以Acidobacteria為主不同；楊虎［32］利用培養(yǎng)和非培養(yǎng)法分析冷藏雞肉胴體中的細(xì)菌多樣性，也得到完全不一致的結(jié)果。本文培養(yǎng)法結(jié)果表明Firmicutes和Bacillus在3種植茶年限中均為優(yōu)勢門屬，原因在于芽孢桿菌具有外層芽孢，能耐高溫，耐酸，在實(shí)驗(yàn)中易被分離到，形成平板優(yōu)勢菌群。高通量測序結(jié)果顯示Acidobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes在3種植茶年限中均屬于優(yōu)勢菌群，與Janssen［33］研究結(jié)果較為一致。Candidatus_Udaeobacter隨著植茶年限增加而比例逐漸變大且優(yōu)勢愈發(fā)明顯，原因在于植茶年限增加會(huì)引起土壤微生態(tài)失調(diào)，單一化群落結(jié)構(gòu)明顯，更利于某種菌的生長［34］。

圖6 茶樹根際細(xì)菌群落與理化因子的相關(guān)性熱圖分析

土壤微生物群落與土壤肥力之間有密切關(guān)系，養(yǎng)分含量嚴(yán)重影響土壤微生物數(shù)量和多樣性［35］。據(jù)報(bào)道，增加有效磷（AP）可以提高微生物多樣性［36］；pH值是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的最強(qiáng)因素［37-38］，改善土壤pH對土壤微生物量和細(xì)菌群落多樣性具有積極意義［39］；全鉀（TK）與茶園生產(chǎn)力、細(xì)菌多樣性密切相關(guān)［40］；土壤中總氮（TN）可以影響微生物生物量［41］。本研究結(jié)果表明隨著植茶年限的增加，TN、TK、AP、pH均呈現(xiàn)出下降趨勢，從而導(dǎo)致細(xì)菌群落的數(shù)量和多樣性也隨之降低。同時(shí)結(jié)合高產(chǎn)茶園土壤主要養(yǎng)分指標(biāo)分析，隨著植茶年限的增加，有必要采取措施防止土壤酸化，同時(shí)增施氮肥和磷肥，以提高茶園產(chǎn)量和品質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)法采用的培養(yǎng)基較單一，具有局限性，所獲得的細(xì)菌數(shù)量和種類均較少，但其優(yōu)勢在于成本低、獲取的菌體純度高，是分離目標(biāo)物種的重要手段，同時(shí)也保存了微生物菌種資源，用于實(shí)際生活生產(chǎn)方面。例如：通過培養(yǎng)法獲得的Viridibacillus arenosi可降解霉變玉米粉中的黃曲霉毒素B-1［42］；耐高溫的α淀粉酶也是由培養(yǎng)法獲得的芽孢桿菌產(chǎn)生［43］。高通量測序技術(shù)與培養(yǎng)法相比能更全面地反映不同植茶年限下茶樹根際細(xì)菌的物種組成及豐度信息。但是高通量測序技術(shù)獲取的信息量巨大，其歸類整合沒有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，而且高通量測序技術(shù)僅以微生物DNA為檢測基礎(chǔ)，故無法區(qū)分死菌與活菌。綜上所述，我們在實(shí)際過程中，需要將這兩種方法相結(jié)合，以求獲取全面準(zhǔn)確的信息，為改善茶樹的土壤和提高茶樹產(chǎn)量、后期研制微生物菌肥提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，本實(shí)驗(yàn)僅對細(xì)菌群落進(jìn)行了分析，對于茶園土壤其他種類的微生物類群，如真菌、放線菌等分布狀況，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

不同植茶年限下的漢中茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性豐富。在細(xì)菌群落構(gòu)成方面，傳統(tǒng)培養(yǎng)法：厚壁菌門和芽孢桿菌屬在植茶年限為5年、10年、20年中均為優(yōu)勢門屬；高通量測序技術(shù)：酸桿菌門、變形菌門、擬桿菌門和Candidatus_Udaeobacter在3種植茶年限中為優(yōu)勢門屬。植茶年限增加會(huì)使茶園土壤呈酸化趨勢，且逐漸低于優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)茶園土壤的最低標(biāo)準(zhǔn)。總氮、總鉀、總磷、pH是影響漢中茶樹細(xì)菌群落的關(guān)鍵理化因子；隨著植茶年限增加，要采取必要措施防止土壤酸化，適當(dāng)增施氮肥和磷肥。