李希凡 ，韓紅梅 ，王志強 ，鄭文超 ，李天祥

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.河北生之谷農業(yè)科技有限公司，石家莊 050200）

半夏為天南星科植物半夏 [Pinellia ternate（Thunb.）Breit.]的干燥塊莖。其味辛、溫，有毒。歸脾、胃、肺經。具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結等功效。本品是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材，至今有達兩千多年的用藥歷史[1]。通過對常用588個中藥處方分析可知，半夏出現(xiàn)頻率位于第22位；在日本210個漢方中有半夏者46個，占22%；在300個常用痰嗽方中用半夏者有142個，約占46%，半夏為最廣泛應用的30種中藥之一[2]。西醫(yī)學研究表明，半夏主要含有機酸、生物堿、半夏蛋白、揮發(fā)油、氨基酸、多糖和無機元素等化學成分，其中有機酸為半夏祛痰止咳成分，生物堿類具有鎮(zhèn)吐效果，多糖類有扶正祛邪、增強免疫力的作用[3-5]。2015版《中華人民共和國藥典》以琥珀酸作為指標成分，但中藥以多成分、多靶點、多層次發(fā)揮治療作用。因此，本研究基于半夏的藥效物質基礎，以總浸出物、多糖類、有機酸、生物堿為考察指標，采用多組分對半夏進行整體質量評價，來全面反映不同產地以及野生與栽培半夏整體質量特征，為其臨床運用提供參考。

1 材料、儀器與試劑

1.1 藥材來源 為了客觀反映不同產地半夏藥材，對不同產區(qū)的主要產地，收集多個樣地的樣品。藥材來源于5個產區(qū)17個產地及樣地，樣品去除泥沙與雜質，干燥，粉碎，過4號篩，備用。樣品信息見表1（栽培年限為1年）。

1.2 儀器 自動電位滴定儀（上海禾工科學儀器有限公司），紫外可見光分光光度計（上海美普達有限公司），遠紅外快速干燥箱（上海賀德實驗設備有限公司），電子天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司），二列四孔智能水浴鍋（河南省鞏義市儀器有限責任公司），調溫電熱套（山東省鄄城永興儀器廠），超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿有限公司），循環(huán)水式多用真空泵（同上），無油空氣泵（天津市津分分析儀器制造有限公司），移液槍（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 試劑 硫酸（分析純，天津市化學試劑五廠），蒽酮（分析純，上?？曝S化學試劑有限公司），無水乙醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司），娃哈哈純凈水（天津娃哈哈宏振飲料有限公司），正丁醇（分析純，天津市江天化工技術有限公司），氯仿（分析純，同上），甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司），氫氧化鈉標準滴定液（濃度：0.1015 mol/L，GB/T601-2016，同上）、鹽酸標準滴定液（濃度：0.1026 mol/L，GB/T601-2016，同上）。標準品：無水葡萄糖（批號：MUST-11020603，北京鼎國昌盛技術有限公司）、鹽酸麻黃堿（批號：171241-201508，中國食品藥品檢定研究院）。

表1 5個產區(qū)17個產地及樣地半夏藥材樣品采集信息表Tab.1 Collection information of Pinellia ternate samples from 17 producing areas and sample sites in 5 production areas

2 方法

2.1 總有機酸含量的測定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱定半夏粉末約5g，置錐形瓶中，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，同上操作，再重復提取2次，放冷，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣精密加入氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）10 mL，超聲處理（功率 500 W、頻率 40 kHz）30 min，轉移至50 mL量瓶中，加新沸過的冷水至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 測定方法 精密量取25 mL供試品溶液，照電位滴定法（2015版《中華人民共和國藥典》四部通則0701）測定，用鹽酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，并將滴定的結果用空白實驗校正。每1mL氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）相當于 5.904 mg的琥珀酸（C4H4O4）。

滴定終點確定：自動電位滴定儀根據實驗得到的電位E值和滴定體積V值繪制一級微商ΔE/ΔV曲線，曲線峰值對應的體積即為滴定終點。

2.1.3 樣品含量測定 取半夏樣品按“2.1.1”項下方法制備樣品，按“2.1.2”項下方法進行測定，計算半夏有機酸的含量，重復3次，結果取算術平均值。

2.2 總生物堿和多糖含量的測定

2.2.1 供試品溶液的制備總生物堿 精密稱定半夏樣品粉末約0.25 g，置50 mL錐形瓶中，加濃氨水0.5 mL，濕潤后，加氯仿10 mL，稱定質量。冷浸3 h后超聲提取1 h，加氯仿補質量，過濾，殘渣以氯仿10 mL分3次洗滌，合并濾液與洗液，60℃以下旋轉蒸發(fā)回收氯仿至干。加入氯仿8.0 mL溶解并轉移至分液漏斗中，依次加入0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液10 mL和溴麝香草酚藍標準液1.0 mL，充分振搖，靜置20 min，分取氯仿層，水層再用氯仿同法萃取2次，每次8 mL。合并氯仿層，用氯仿定容于25 mL量瓶中，即得總生物堿供試品溶液。

溴麝香草酚藍標準液配制方法：取0.1 g溴麝香草酚藍，精密稱定，溶于50%乙醇，定容至100 mL容量瓶即得。

多糖[6-8]精密稱定半夏藥材干燥粉末0.5 g，置于150 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇50 mL，水浴回流2次，每次0.5 h，過濾，棄去兩次濾液，回收濾渣，濾渣加蒸餾水50 mL，回流2次，每次1 h，過濾，合并兩次濾液，活性炭脫色后轉移定容至100 mL容量瓶中，取0.4 mL溶液稀釋至10 mL容量瓶中，取2 mL加入至25 mL具塞試管中，冰水浴中緩慢滴入5 mL質量分數(shù)0.2%的硫酸蒽酮，搖勻，置于沸水浴中10 min，取出，冰水浴冷卻后即得多糖供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸麻黃堿對照品約4.0 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得鹽酸麻黃堿濃度為0.16 mg/mL的對照品溶液。

取無水葡萄糖標準品精密稱定1.7 mg，加入蒸餾水定容至25mL容量瓶中，即得濃度為0.68 mg/mL葡萄糖對照品溶液。

2.2.3 檢測條件 取總生物堿、多糖供試品溶液于紫外413、625 nm波長處測定吸光度，并根據吸光度計算總生物堿及多糖含量。

2.2.4 方法學考察 線性關系考察分別精密吸取1.5、1.8、2.1、2.4、2.7、3.0、3.3、3.5 mL 的鹽酸麻黃堿對照品溶液至分液漏斗中，加蒸餾水至2.0 mL，加氯仿8.0mL，再依次加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液10mL和溴麝香草酚藍標準液1.0 mL，充分振搖，靜置15 min，分取氯仿層，水層再用氯仿同法萃取2次，每次8 mL。合并氯仿層，用氯仿定容于25 mL量瓶中，即得。以相應的試劑同法制作空白。在波長413nm處測定吸光度。繪制標準曲線，得線性回歸方程：Y=4.349 4X-0.360 5，R2=0.999 3，表明鹽酸麻黃堿含量在0.120 0～0.280 0 mg范圍內線性關系良好。

分別精密取對照品溶液 0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.00、1.10 mL，蒸餾水定容至 10 mL，配制成濃度為 0.003 4、0.010 2、0.020 4、0.030 6、0.040 8、0.051 0、0.061 2、0.068 0、0.074 8 mg/mL 的葡萄糖系列對照品溶液。在“2.2.3”項方法下分別測定吸光度，以吸光度（Y）對濃度（X）做曲線，得線性回歸方程Y=10.89 3X-0.005 1，R2=0.999 8，表明葡萄糖濃度在0.003 4～0.074 8 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 重復性考察 按“2.2.1”項下總生物堿和多糖供試品溶液的制備方法分別取同一樣品各制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項下檢測條件測定吸光度，RSD值分別為2.86%和2.56%，表明重復性良好。

2.2.6 精密度考察 精密量取總生物堿和多糖的對照品溶液，按“2.2.3”項下檢測條件測定吸光度，分別連續(xù)測量 6次，RSD值分別為 0.069%和0.059%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取一樣品，按“2.2.1”項下方法分別制備總生物堿和多糖的供試品溶液，按“2.2.3”項下檢測條件于 0、0.5、1、1.5、2、2.5 h 測定吸光度，RSD值分別為0.14%和0.16%，表明樣品至少在2.5 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加標回收率考察 精密稱量已知總生物堿和多糖含量的樣品粉末0.5 g，各6份，分別加入對照品適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算兩者加標回收率。平均加標回收率分別為100%、98.8%，RSD分別為2.65%、3.87%。

2.2.9 樣品含量的測定 取半夏樣品按“2.2.1”項制備樣品，在“2.2.3”項方法下測定吸光度，按回歸方程計算總生物堿和多糖含量，各重復3次，結果取算術平均值。

2.3 浸出物含量的測定

2.3.1 浸出物的制備方法 取供試品約4 g，精密稱定，置250 mL的錐形瓶中，精密加水100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補足失重，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。

2.3.2 樣品含量測定 取半夏樣品按“2.3.1”項下方法制備樣品，計算半夏浸出物的含量，重復3次，結果取算術平均值。

2.4 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。主要是方差分析和主成分分析。

3 結果與分析

3.1 不同產地半夏各成分含量及方差分析 見表2。

表2 5個產區(qū)17個產地及樣地半夏各成分含量（±s，n=3）Tab.2 Content of active components of Pinellia ternate in 17 producing areas and sample sites in 5 producing areas（±s，n=3） mg/g

表2 5個產區(qū)17個產地及樣地半夏各成分含量（±s，n=3）Tab.2 Content of active components of Pinellia ternate in 17 producing areas and sample sites in 5 producing areas（±s，n=3） mg/g

注：同一列沒有相同英文字母者，表示差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；有相同英文字母者，則表示差異無統(tǒng)計學意義。

樣品編號 浸出物 多糖類 生物堿類 有機酸類1 325.33±0.26fg165.66±0.18fg 0.53±0.01de 2.05±0.15d 2 348.33±0.25e 203.05±0.19bc 0.50±0.00f 2.41±0.16c 3 229.41±0.34j 149.10±0.34h 0.59±0.01b 2.75±0.18bc 4 277.94±0.26h 177.75±0.12e 0.58±0.01c 1.91±0.36d 5 464.49±0.14b 190.90±0.25d 0.50±0.01f 3.94±0.17a 6 317.00±0.14fg214.19±0.10a 0.50±0.01f 3.37±0.07ab 7 373.66±0.35d 168.59±0.27f 0.59±0.01bc1.06±0.26e 8 392.65±0.05c206.42±0.05b 0.54±0.01d 3.08±0.16b 10 202.83±0.16k143.50±0.14hi 0.53±0.01d 2.59±0.35bc 11 332.12±0.30f175.60±0.28e 0.58±0.01bc2.25±0.26cd 12 394.32±0.24c 199.03±0.10c 0.50±0.00f 4.31±0.77abcde 13 497.76±0.38a 161.61±0.48g 0.50±0.00f 3.26±1.22ab 14 235.07±0.31i 171.51±0.25ef 0.70±0.01a 2.66±0.19bc 15 310.80±0.40g 185.21±0.17d 0.52±0.01e 3.54±0.33ab 16 407.86±0.23c 141.54±0.19i 0.49±0.00f 3.27±0.74ab 9（硫熏） 314.52±1.84 202.79±3.61 0.55±0.02 2.84±0.07 17（硫熏） 243.35±6.45 134.53±1.97 0.49±0.00 2.23±0.03

由表2可知，不同產地半夏（除去硫熏的樣品）各化學組分含量有較大差異。1）基于藥典指標成分琥珀酸的含量（2.5 mg/g），12號湖北荊州樣品含量最高，為4.31 mg/g；在15個樣品中5個樣品的含量低于藥典限量標準，各產地樣品琥珀酸的含量在1.06～4.31 mg/g之間，最高者是最低者約3倍以上，說明當前市場流通的半夏藥材質量參差不齊，并存在一定量的不合格藥材。2）基于生物堿類含量，約在0.49～0.70 mg/g之間，14號河北安國樣品含量最高，為0.70 mg/g，但與其他產地相比，無顯著性差異，各產地含量水平相當，波動不大。3）各產地的浸出物的含量差異較大，其中13號湖北荊州樣品為497.76 mg/g，遠高于其他產地樣品含量，且具有顯著性差異。4）各產地樣品多糖類的含量差異較大，甘肅產區(qū)平均含量整體較高，最高者6號甘肅西和樣品含量為214.19 mg/g。

3.2 不同產地半夏（無硫熏）各藥效活性成分主成分分析 主成分分析是利用降維思想，把多個指標轉化成少數(shù)幾個綜合指標的一種統(tǒng)計學方法。其目的之一是在盡可能減少損失的基礎上得到幾個綜合因子來代表原來眾多變量。半夏是多組分的復合體，因此，采用主成分分析法對本實驗中測定的4類化學成分進行評價，綜合考察半夏藥材的品質特征。

除去硫熏樣品的干擾，將不同產地半夏化學組分數(shù)據進行標準化處理后，利用SPSS對表2數(shù)據進行分析。SPSS分析結果顯示，KMO=0.686，巴特利球性檢驗Sig值為0.000＜0.05，數(shù)據適宜進行主成分分析。

主成分載荷的大小表明主成分能解釋原始變量的程度，結合表3中的數(shù)據可知：第一主成分與浸出物、生物堿、有機酸的相關性較強，基本能夠代表半夏中此3種化學組分的綜合水平，貢獻率為53.33%；第二主成分主要與生物堿存在較強的相關性，貢獻率為21.11%，因此這兩個主成分基本反映了原始數(shù)據的大部分信息，可以體現(xiàn)半夏藥效成分的整體水平。

表3 主成分載荷矩陣及解釋的總方差Tab.3 Principal component load matrix and total variance of interpretation

以F1和F2的貢獻率與兩者累計貢獻率的比值作為權數(shù)，并以F=0.716F1+0.284 F2求出綜合得分值。由表4、表5結果可知，基于第一主成分和綜合主成分得分：1）湖北荊州、甘肅西和半夏浸出物、生物堿、有機酸化學組分含量豐富，整體水平較高，說明湖北荊州和甘肅西和兩地作為半夏優(yōu)質產地具備一定的合理性。2）3個產地野生藥材樣品整體水平較高。將貴州省赫章縣的野生和栽培樣品進行比較，并結合湖北荊州2個野生樣品，野生半夏的浸出物、多糖類、有機酸類含量均高于栽培半夏，生物堿類的含量略低于栽培半夏。說明野生品半夏各化學組分含量總體水平較高，野生品質優(yōu)于栽培半夏。見表6。

表4 15個半夏藥材樣品主成分值、綜合主成分得分Tab.4 Principal component values and comprehensive principal component scores of 15 samples of Pinellia ternate

表5 8個產地半夏藥材主成分均值、綜合主成分得分均值Tab.5 Mean value of principal component and comprehensive principal component scores of Pinellia ternate from 8 producing areas

表6 野生和栽培半夏各藥效活性成分含量（除去硫熏的加工方法）Tab.6 Content of active components in wild and cultivated Pinellia ternate（processing method for removal of sulfur fume） mg/g

3.3 硫熏對半夏各藥效活性成分含量影響的分析 基于半夏硫熏的加工方法，對比了同一產地甘肅清水縣和河北鹿泉硫熏后的樣品，結果顯示，硫熏半夏浸出物、多糖類、有機酸類成分均下降，其中浸出物下降最多，兩樣品平均下降30%，有機酸也降低20%，生物堿類成分基本保持不變?？梢?，硫熏過程使半夏各活性成分含量下降，見表7。

表7 硫熏加工方法對半夏化學組分含量的影響（n=3）Tab.7 Effect of sulfur fumigation on chemical constituents of Pinellia ternate（n=3）

4 討論

4.1 湖北荊州、甘肅西和是半夏的優(yōu)質產地 半夏為中國歷史悠久的傳統(tǒng)中藥材，其道地產區(qū)和主產地出現(xiàn)過較大變遷。唐代以前，半夏以陜西一帶所產為主，逐漸移至山東、江蘇等地，而后以湖北、河南、山東一帶為主產區(qū)，經歷了一個由西到東，又由東至西的歷史變遷過程。目前，半夏主要栽培于甘肅、湖北、貴州、山西、河北等地[9]，文章通過對不同產地半夏樣品各藥效成分含量的測定和主成分分析，湖北荊州、甘肅西和半夏具有豐富的藥效物質基礎，其藥材整體質量較高，兩地作為半夏的優(yōu)質產地是有一定道理的。這也與古代本草中“產湖北荊州為最”和相關文獻中的描述相一致[10]。

4.2 半夏化學成分累積的影響因素 優(yōu)質藥材的形成依賴于三大成因條件，即特定的生境（道地產區(qū)）、遺傳因素（優(yōu)良品種）、人為因素（栽培、采收、炮制加工技術）。湖北荊州和甘肅西和屬于丘陵或山林地帶，地勢相對較陡峭，利于疏水，土壤類型以壤土為主，氣候較溫暖，年均氣溫相對較低，符合半夏喜陰的習性。通過調查發(fā)現(xiàn)，這兩地的半夏種源相對較純正，但通過實驗發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質產地也有不合格品的存在，這可能是由于大田多年種植，產生連作障礙以及土壤微生物失衡的結果。半夏忌旱怕澇，適宜的栽培、采收與加工技術對高品質半夏的形成，至關重要，湖北荊州和甘肅西和作為半夏的主要產地，在生產技術上相對比較成熟，為優(yōu)質藥材的形成提供了堅定的基礎。

4.3 野生半夏與栽培半夏 目前，半夏以培植為主，本研究收集野生樣品較少，但通過對野生與栽培半夏藥效成分含量考察，發(fā)現(xiàn)野生半夏各藥效成分含量均高于栽培品。這可能是因為野生半夏在自然環(huán)境下生長時間長而緩慢，次生代謝產物積累豐富，而栽培品半夏水肥條件優(yōu)越，土壤營養(yǎng)充足，在整個生長過程中，生物量增加較快，塊莖體積較大，次生代謝產物累積卻相對較少。同時，觀察野生與栽培半夏性狀特征，發(fā)現(xiàn)野生半夏塊莖較小，多數(shù)呈規(guī)則的類圓形，而栽培半夏塊莖較大，且多側生小塊莖。因此，營養(yǎng)因素是造成栽培半夏品質低于野生半夏的主要原因之一，這與張綠明[11]的研究結果一致。

4.4 硫熏對半夏品質的影響 硫熏是利用硫磺燃燒時產生的二氧化硫蒸制藥材的加工方法，有利于藥材的干燥和保存，同時二氧化硫的還原性可以保持半夏藥材原有的色澤，有效抑制霉變和褐變反應。文章考察了硫熏對半夏藥效成分的影響，實驗結果表明硫熏會使半夏藥材各活性成分減少，同時，過量的硫熏還會使砷、汞等元素進入藥材中[12]。因此半夏的產地加工中不宜采用硫熏。

5 結論

研究從不同產地采集樣品，基于半夏3大功效成分及浸出物含量，全面而系統(tǒng)考察了不同產地半夏藥材整體質量特征。湖北荊州、甘肅西和兩地藥材各化學組分總體水平較高，各產地藥材質量參差不齊；半夏由野生變家種，品質降低；硫熏造成了半夏有效成分含量降低和二氧化硫的殘留，影響臨床療效和用藥安全。