秦緒偉 王景偉 王家棟

肉毒梭菌毒力以其毒素滅活疫苗的效力試驗

秦緒偉 王景偉 王家棟

（齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100）

肉毒梭菌毒素毒力強，可以作為滅鼠的藥物，現(xiàn)將肉毒梭菌C株菌液上清適當稀釋，進行小鼠毒力試驗。結果表明，肉毒梭菌C株菌液上清對小鼠的最小致死量為5.0×104MLD/ml，可以作為草原、牧場、其他養(yǎng)殖場滅鼠的參考依據(jù)。將毒素滅活制備疫苗，進行免疫小鼠，對小鼠具有保護力，可以抵抗致死量毒素的攻擊。

肉毒梭菌 小鼠 毒力 毒素

肉毒梭菌是指能夠產(chǎn)生肉毒梭菌毒素，引起動物中毒的細菌總稱，其中C型肉毒梭菌最為常見，細菌呈現(xiàn)桿狀或者略微彎曲，一般單個存在，革蘭氏染色陽性。有周鞭毛，無莢膜，芽孢卵圓形[1]。肉毒梭菌毒力極強，1mg毒素純品能使1萬人或者4×1012只小鼠致死[2]。傳統(tǒng)的食物肉毒中毒，有進食被污染的食物中已存在肉毒梭菌毒素引起[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 肉毒梭菌C株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試驗動物 16~20gSPF級別昆明小鼠，購自山東大學實驗動物中心。

1.1.3 耗材 培養(yǎng)基，肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基；TG小管、GA斜面、GP小管，肉肝湯半固體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基等按照常規(guī)方法實驗室配制；生化試驗試劑、微量生化鑒定管購自北京陸橋技術有限責任公司。（1）成分以及比例：牛肉200g、牛肝50g、胃蛋白酶3~4g、鹽酸10~11ml、蛋白胨10g、胡精10g、純化水1000ml。（2）制備方法：在65℃左右溫水內(nèi)加入鹽酸和攪碎的牛肉、肝，充分攪拌均勻，再加入胃蛋白酶充分攪拌，混合后的溫度在56~58℃；置53~55℃消化22~24h，前10h每小時充分攪拌1次；提取上清液，加熱至80℃，然后加入蛋白胨煮開，調節(jié)pH至7.6~7.8.煮沸10min，濾過或者經(jīng)過沉淀后取上清，按照量加入糊精溶解后分裝，116℃滅菌40min。

1.2 方法

1.2.1 肉毒梭菌的鑒定 （1）純粹試驗：取肉毒梭菌C株接種TG小管、GA斜面、肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基各2支，0.2ml/支，1支置37℃培養(yǎng)，1支置25℃培養(yǎng)，另取肉毒梭菌接種1支GP小管，0.2ml，置25℃培養(yǎng)，觀察7d，記錄細菌生長情況。（2）培養(yǎng)特性：取肉毒梭菌C株菌種接種肉肝半固體培養(yǎng)基、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基(加新鮮的肝塊)、鮮血瓊脂平板(厭氧條件下培養(yǎng))，37℃培養(yǎng)，觀察細菌生長情況。（3）生化試驗：①糖發(fā)酵試驗：將待檢菌株的新鮮培養(yǎng)物，接種糖發(fā)酵管培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24~48h，觀察糖發(fā)酵培養(yǎng)管的顏色是否變色，若變色則為陽性，不變色則為陰性；如為陰性，繼續(xù)觀察5d。如培養(yǎng)基仍仍然呈現(xiàn)未接種前的顏色，為陰性反應。②硫化氫試驗：去待檢菌株培養(yǎng)物，穿刺接種三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h，觀察培養(yǎng)基底部是否出現(xiàn)黑色。培養(yǎng)基底部出現(xiàn)黑色即為陽性反應，未出現(xiàn)黑色為陰性反應。③過氧化氫酶試驗：取干凈的載玻片，在上面滴數(shù)滴3%過氧化氫溶液，挑取一環(huán)固體培養(yǎng)基的菌落，在過氧化氫溶液中混合均勻。若有氣泡則為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。

1.2.2 肉毒梭菌的培養(yǎng) 將肉毒梭菌C株菌種接種加入肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)5d，收獲菌液，離心去除菌體，0.22um濾膜過濾除菌，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 毒力試驗 取肉毒梭菌C株毒素用明膠緩沖液進行5.0×10-3稀釋，然后進行2倍系列稀釋，每個稀釋度尾靜脈注射2只16~20g的SPF級昆明小鼠，0.2ml/只，連續(xù)觀察5d，記錄小鼠死亡情況。

1.2.4 疫苗制備 取第5代肉毒梭菌C株接種肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基，同時加入滅菌葡萄糖溶液，使其終濃度為0.5%，35℃靜止培養(yǎng)5~7d，取樣測定菌液上清毒素含量，菌液經(jīng)甲醛滅活、脫毒完全后離心，去除菌體。用無菌生理鹽水調整毒素含量為5萬小鼠MLD/ml，與無菌氫氧化鋁膠9:1比例混合均勻，再加入1%的硫柳汞溶液，使其終濃度為0.01%，充分攪拌，制備疫苗。

1.2.5 疫苗效力 取16~20gSPF級別昆明小鼠25只，平均分成5組，每組5只，皮下接種制備好的疫苗，分別為0.5ml/只、0.1ml/只、0.05ml/只、0.01ml/只，共計20只，另外取5只條件相同作為對照，免疫后21d，免疫小鼠和對照小鼠分別進行靜脈注射10只小鼠MLD肉毒梭菌毒素，連續(xù)觀察7d，記錄小鼠死亡情況。

2 結果

2.1 肉毒梭菌的鑒定

取接種肉毒梭菌的肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基菌液，進行革蘭氏染色，結果鏡檢觀察可見革蘭氏陽性粗大桿菌。培養(yǎng)可見在肉肝胃酶消化湯半固體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)中等生長，在厭氣肉肝湯中生長不良或者不生長，培養(yǎng)基加入新鮮的肝塊，生長良好，產(chǎn)氣，有臭味。在鮮血瓊脂平板上厭氧條件下，37℃培養(yǎng)48h，菌落不規(guī)則呈現(xiàn)圓形，直徑3mm左右，半透明，邊緣不整齊，有略大于菌落的溶血環(huán)。生化試驗可見發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，不發(fā)酵乳糖和麥芽糖，硫化氫試驗培養(yǎng)基底有黑色，呈現(xiàn)陽性反應。過氧化氫酶試驗結果不產(chǎn)生氣泡，呈現(xiàn)陰性反應。

2.2 肉毒梭菌對小鼠毒力結果

取肉毒梭菌C株菌液上清使用，系列稀釋對小鼠攻毒，攻毒后第2天小鼠開始出現(xiàn)四肢癱軟、無力、呼吸困難等癥狀；攻毒后第2天、第3天5.0×10-3稀釋組、1.0×10-4稀釋組小鼠全部死亡，攻毒后第4日2.0×10-4稀釋組小鼠死亡1只。根據(jù)試驗結果，該批毒素對小鼠的最小致死量為5.0×104MLD/ml(見表1)。

表1 肉毒梭菌對小鼠毒力結果

2.3 取肉毒梭菌菌種接種培養(yǎng)基

收取菌液滅活制備疫苗，免疫小鼠后21d攻毒，觀察7d，可見0.5ml/只、0.1ml/只實驗組小鼠全部健活，0.05ml/只實驗組小鼠第3天死亡2只，其余3只小鼠健活，0.01ml/只試驗組5只小鼠第2天全部死亡，對照組5只小鼠第2天全部死亡(見表2)。

表2 肉毒梭菌疫苗對小鼠免疫后攻毒結果 (ml/只、%)

3 討論

（1）肉毒梭菌是廣泛分布于環(huán)境中的一種細菌，存在于土壤、沼澤、水渠中，以及動物尸體和飼料中，在動物尸體和飼食物料中生長后產(chǎn)生大量的外毒素，一般不會造成傳染，只會是吃食食物飼料引起中毒發(fā)病。（2）吃入肉毒梭菌也可以體內(nèi)增殖生長產(chǎn)生毒素引起中毒，動物發(fā)病主要是動物吃腐敗的動植物尸體，毒素污染的食物，引起中毒。肉毒毒素為蛋白類嗜神經(jīng)麻痹毒素，阻斷膽堿能神經(jīng)末梢傳遞介質—乙酰膽堿的分泌和釋放，使運動神經(jīng)末梢麻痹。（3）中檢所購買的肉毒梭菌C株使用肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)，檢測毒素毒力最小致死量為5.0×104MLD/ml?，F(xiàn)在在很多草場也用于老鼠的殺滅，有的牧場、養(yǎng)殖場用于滅鼠。（4）預防本病主要是處理動物尸體，防止腐敗的尸體成為動物飼料。人感染發(fā)病主要是飲食習慣有關系，歐美國家發(fā)病主要是肉類食品、罐頭食品引起，我國的發(fā)酵食品臭豆腐、豆腐乳等都會引起本病，嬰兒奶粉也曾檢出過肉毒梭菌。疫苗免疫是本病預防的一個重要手段，中檢所有規(guī)程產(chǎn)品，青海、西藏養(yǎng)牛使用效果確實。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(第5版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013: 192-202.

[2] 夏咸柱. 野生動物疫病學[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011: 785-790.

[3] 周庭銀. 臨床微生物學診斷與圖解(第2版)[M]. 上海: 上?？茖W技術出版社, 2006: 303.

（2019–10–12）

S852.61+6.3

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