任士飛 張林吉* 遲蘭 房超

試驗(yàn)研究

鴨沙門菌高密度發(fā)酵工藝的研究

任士飛①?gòu)埩旨?遲蘭①房超②

（①徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇 徐州 221006 ②中華人民共和國(guó)徐州海關(guān) 江蘇 徐州）

為了提高鴨沙門菌的生產(chǎn)量，簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程降，低生產(chǎn)成本。以GMP為生產(chǎn)指導(dǎo)原則，采用10L發(fā)酵罐對(duì)影響鴨印第安納沙門菌高密度發(fā)酵的溫度、pH值、相對(duì)溶氧量、接種量等7個(gè)方面進(jìn)行單因子優(yōu)化試驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，鴨印第安納沙門菌在以4%接種量，培養(yǎng)溫度為38℃，維持培養(yǎng)基的pH值為7.5，保持溶氧量為40%，150rpm/min的轉(zhuǎn)速和連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖的方式培養(yǎng)20h后，發(fā)酵菌數(shù)可達(dá)到53.7億CFU/ml，本研究結(jié)果為沙門菌疫苗大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

鴨沙門菌 高密度發(fā)酵 優(yōu)化

鴨沙門菌病(Duck Salmonellosis)又稱為鴨副傷寒，是鴨的一種急、慢性傳染病，主要由于鴨感染了一種或幾種沙門氏菌而引起，病原菌主要包括鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鴨沙門氏菌和印第安納沙門氏菌等[1, 2]。大多數(shù)情況下，鴨沙門氏菌病多發(fā)生于雛鴨，成年鴨感染沙門菌常屬隱性感染，但有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床疾病，并伴有高死亡率。高密度發(fā)酵培養(yǎng)是進(jìn)行細(xì)菌疫苗生產(chǎn)的一種主要發(fā)酵工藝。采用發(fā)酵罐培養(yǎng)，可以縮小生物反應(yīng)器的體積，簡(jiǎn)化培養(yǎng)基的制備，提高單位體積菌體的密度及產(chǎn)量，從而降低疫苗生產(chǎn)成本。影響高密度發(fā)酵的因素很多，如細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的培養(yǎng)基成分及pH值、接種密度、培養(yǎng)溫度及時(shí)間、溶氧濃度及攪拌速度和補(bǔ)料方式等。

本研究針對(duì)徐州地區(qū)鴨沙門菌主要流行血清型-印第安納沙門菌，在GMP原則的指導(dǎo)下，對(duì)印第安納沙門菌進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)影響培養(yǎng)因素進(jìn)行探究?jī)?yōu)化，有效提高疫苗的生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基 印第安納沙門菌為徐州動(dòng)物疫病工程技術(shù)研究中心分離鑒定并保存，沙門菌合成培養(yǎng)主要成分：胰蛋白胨和酵母浸粉(購(gòu)自O(shè)XOID公司)、葡萄糖、KH2PO4、NaH2PO4、NaCL、NaCO3、NaOH、賴氨酸等化學(xué)試劑(購(gòu)自南京智睿生物科技有限公司)、LB固體培養(yǎng)基(購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 主要儀器 10L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司)、便攜式酸度(上海雷磁儀器廠)、溶氧分析儀(希仕代儀器貿(mào)易(上海)有限公司)。

1.2 方法

培養(yǎng)條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)按照單因子順序進(jìn)行，每項(xiàng)優(yōu)化的結(jié)果都用于以后的試驗(yàn)，共進(jìn)行以下7個(gè)參數(shù)的優(yōu)化，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，按照現(xiàn)行中國(guó)獸藥典方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[3]。

1.2.1 培養(yǎng)溫度優(yōu)化 在6L合成培養(yǎng)基中，按照3%的接種量，200rpm/min，保持溶氧指數(shù)在40%，溫度設(shè)定35~40℃之間，pH值為7.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.2 pH值優(yōu)化 按照3%的接種量，38℃，200rpm/min，保持溶氧指數(shù)在40%，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，發(fā)酵過(guò)程中采用通過(guò)滴加NaOH溶液、NaCO3溶液或賴氨酸溶液三種方式來(lái)維持培養(yǎng)基pH值恒定，培養(yǎng)18h，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.3 接種量?jī)?yōu)化 按照不同的接種量1.5%、2%、2.5%、3%、4%和5%，38℃，200rpm/min，保持溶氧指數(shù)在40%，在pH值為7.5為培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.4 通氣量?jī)?yōu)化 按照4%的接種量，38℃，200rpm/min，在pH值為7.5為培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵過(guò)程中以不同的通氣量，使溶氧指數(shù)到達(dá)20%、30%、40%、50%和60%，培養(yǎng)18h，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.5 轉(zhuǎn)速優(yōu)化 按照4%的接種量，38℃，保持溶氧指數(shù)在40%，轉(zhuǎn)速設(shè)為100rpm/min、150rpm /min、200rpm/min、300rpm/min，在pH值為7.5為培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.6 培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化 按照4%的接種量，38℃，保持溶氧指數(shù)在40%，轉(zhuǎn)速150rpm/min，在pH值為7.5為培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h后，每隔2h取樣，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.7 補(bǔ)加碳源優(yōu)化 按照4%的接種量，培養(yǎng)溫度38℃，保持溶氧指數(shù)在40%，轉(zhuǎn)速為150rpm /min。培養(yǎng)8h后，開始補(bǔ)加濃度為50%的葡萄糖溶液0.5L，補(bǔ)加采用三種方式：一次性補(bǔ)加；分4次補(bǔ)加，每次間隔2h；連續(xù)流加至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)20h，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度優(yōu)化

沙門菌發(fā)酵培養(yǎng)菌體密度隨溫度升高而升高，但在37.5~38℃時(shí)增長(zhǎng)速度最佳，溫度超過(guò)38℃后，活菌數(shù)量開始減少，不同溫度下菌體密度如表1所示。綜合沙門菌培養(yǎng)特性、溫度和最終菌體密度等因素，本試驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)溫度為38℃。

表1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體密度的影響 (億CFU/ml)

2.2 pH值優(yōu)化

細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，pH值在7.5~8.0時(shí)最終菌體密度達(dá)到最大，pH值過(guò)低或過(guò)高，最終菌體密度都降低，均達(dá)不到良好的培養(yǎng)效果(見表2)。保持培養(yǎng)基的pH值在7.5時(shí)，所得到的菌體密度相對(duì)最高，故沙門菌發(fā)酵培養(yǎng)的最適pH值為7.5。

表2 pH值對(duì)菌體密度的影響(菌體計(jì)數(shù)) (億CFU/ml)

2.3 接種量?jī)?yōu)化

接種量可以對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生較大的影響(見表3)。適宜的接種密度有助細(xì)菌的生長(zhǎng)，過(guò)低的接種密度會(huì)使菌體生長(zhǎng)緩慢，過(guò)高的接種密度會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在發(fā)酵早期大量消耗，不利于細(xì)菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)，并且造成種子菌種的浪費(fèi)。所以，選擇4%的接種量較為適宜。

表3 接種量對(duì)菌體密度的影響 (億CFU/ml)

2.4 通氣量?jī)?yōu)化

根據(jù)不同溶氧指數(shù)得到的發(fā)酵系統(tǒng)的菌體密度(見表4)。結(jié)果表明，菌體密度隨著溶氧指數(shù)的增加而增加，但40%以后菌體密度增加緩慢。

表4 通氣量對(duì)菌體密度的影響 (億CFU/ml)

2.5 轉(zhuǎn)速優(yōu)化

細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明，隨著轉(zhuǎn)速的增加菌體密度增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速到達(dá)300rpm/min時(shí)，細(xì)菌計(jì)數(shù)反而降低(見表5)。不同的攪拌速度會(huì)對(duì)溶氧產(chǎn)生一定的影響，但隨著轉(zhuǎn)速的增加會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡，會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，所以，后續(xù)試驗(yàn)采用的最佳轉(zhuǎn)速為150rpm/min。

2.6 培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化

不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體密度測(cè)定結(jié)果顯示(見表6)，18~20h為最佳培養(yǎng)時(shí)間，表明細(xì)菌正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，超過(guò)20h以后菌體密度增加緩慢。為縮短發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，細(xì)菌的收獲應(yīng)在尚未進(jìn)入衰退期前，選擇發(fā)酵時(shí)間為20h為宜。

表6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體密度的影響 (億CFU/ml)

2.7 補(bǔ)加碳源優(yōu)化

補(bǔ)加碳源有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，但不同的碳源補(bǔ)加方式對(duì)菌數(shù)的影響明顯不同(見表7)，結(jié)果顯示以連續(xù)補(bǔ)加方式效果最好。

表7 補(bǔ)加碳源對(duì)菌體密度的影響 (L、億CFU/ml)

3 討論與小結(jié)

（1）發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于獸用細(xì)菌類疫苗的生產(chǎn)，但發(fā)酵工藝是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，不僅涉及到所采用發(fā)酵培養(yǎng)的方式，而且還涉及到具體的發(fā)酵參數(shù)，如溫度、pH值、通氣量等因素[4, 5]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)沙門菌的培養(yǎng)溫度、時(shí)間、pH值、通氣量、接種密度、轉(zhuǎn)速和補(bǔ)加碳源等7項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，基本確定了10L發(fā)酵罐的高密度培養(yǎng)條件。（2）細(xì)菌的生長(zhǎng)發(fā)育受到其環(huán)境pH值影響，pH值的改變會(huì)直接影響菌體密度及產(chǎn)量，因此，在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中要保持一定的pH值[6]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在pH值下降時(shí)采用不同堿性溶液調(diào)節(jié)的效果有一定的差異。采用強(qiáng)堿氫氧化鈉溶液時(shí)，因?yàn)閴A性太強(qiáng)，可使培養(yǎng)基pH值在瞬間有較大幅度的回升，反而不利于菌體的生長(zhǎng)。碳酸鈉對(duì)pH值調(diào)整能力弱，用量較大。賴氨酸為堿性氨基酸，既可以調(diào)節(jié)pH值，又可以明顯促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，適合做為培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)劑。（3）接種量是指接種的種子液體積與發(fā)酵液體積的比列。接種量的大小決定了發(fā)酵初始時(shí)菌體的菌體密度以及菌體后續(xù)生長(zhǎng)速度[7]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)低的接種量會(huì)使菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體密度過(guò)低。但過(guò)高的接種量會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前被消耗，反而會(huì)影響后續(xù)生長(zhǎng)，造成菌體死亡增加，活菌數(shù)量減少。因此，接種量的確定要根據(jù)發(fā)酵的實(shí)際情況，最終確定為4%。（4）溶解濃度是影響細(xì)菌高密發(fā)酵的重要因素之一[8]。溶氧濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)。在一定范圍內(nèi)，溶氧濃度隨著通氣量增加和攪拌速度增加而增大。但，隨著通氣量和轉(zhuǎn)速的增加，會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫，反而會(huì)導(dǎo)致溶氧濃度的降低。所以，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量將溶氧指數(shù)控制點(diǎn)維持恒定。本實(shí)驗(yàn)采用逐漸增大通氣量，由發(fā)酵開始時(shí)的1m2/h，逐漸增加到1.8m2/h，維持發(fā)酵體系溶氧指數(shù)穩(wěn)定在40%。（5）分批補(bǔ)料發(fā)酵是最近流行的一項(xiàng)新技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用與細(xì)胞高密度發(fā)酵。主要包括恒反饋補(bǔ)料和非反饋補(bǔ)料。由于流加方式的不同，它們對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響也不相同。因?yàn)?，指?shù)恒速流加法比較簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜設(shè)備，所以該技術(shù)已廣泛用于大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)[9]。（6）疫苗發(fā)酵生產(chǎn)用的發(fā)酵罐體積較大，一般從幾百升至上千升，不同體積的發(fā)酵罐，其發(fā)酵參數(shù)也不盡相同[10]。未來(lái)將在10L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步嘗試在200L至500L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，并探索一套標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)工藝，使沙門菌的發(fā)酵培養(yǎng)更加簡(jiǎn)便、快速和經(jīng)濟(jì)，進(jìn)一步具備工業(yè)生產(chǎn)化的潛力。

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徐州市科技局重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (KC18155)

（2019–10–21）

S852.61

A

1007-1733(2020)01-0001-03