王立峰，陳俊杰，李永寧，王 玲，王 磊，李雪嬌

大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診科，大連 116011

隨著心肺復蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）理論的發(fā)展及醫(yī)療水平的提高，心臟停搏（cardiac arrest，CA）的復蘇成功率逐年上升，但多數患者恢復自主循環(huán)后仍死于心臟停搏后綜合征（post-cardiac arrest syndrome，PCAS），即心臟停搏復蘇后發(fā)生全身組織缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷，出現多臟器功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的病理生理過程，其中小腸往往成為心臟停搏后復蘇最早發(fā)生I/R 損傷和MODS 的始動器官。CPR 后嚴重的胃腸道I/R損傷，可導致腸內細菌發(fā)生易位，引發(fā)腸源性膿毒癥，甚至出現多臟器功能衰竭，導致患者病死率增加[1-2]。當前，PCAS 的治療是臨床上的一大難題，如何在早期改善腸道缺血及菌群易位已成為治療PCAS 的關鍵因素[3-4]。姜黃素（curcumin）作為一種中藥成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等多種功效[5-7]，但對CPR 后的腸道黏膜是否具有保護作用未見報道。為此本實驗建立CA/CPR大鼠模型，研究姜黃素對腸黏膜組織的保護機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

姜黃素、胱天蛋白酶3（caspase-3）抗體、缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗山羊IgG 二抗（Sigma 公司，美國），二甲基亞砜（天津博迪化工股份有限公司），血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）的ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），TUNEL 法細胞凋亡檢測試劑盒（Roche 公司，瑞士）。動物呼吸機（Harvard 儀器公司，美國），透射電子顯微鏡（TEM，Hitachi 公司，日本）。

1.2 動物分組

SPF 級 雄 性Sprague-Dawley 大 鼠24 只， 體 質 量（320.6±20.5）g，由大連醫(yī)科大學動物中心提供，飼養(yǎng)于大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室SPF 級動物房。實驗動物生產許可證號為SCXK（遼）2020-0001，實驗動物使用許可證號為SYXK（遼）2018-0007。大鼠隨機分為4 組，即對照組（Sham 組）、姜黃素組（Cur 組）、CPR后腸I/R 損傷組（I/R 組）、姜黃素+CPR 后腸I/R 損傷組（Cur+I/R 組），每組6 只。Sham 組、Cur 組麻醉后行氣管插管，股動脈、股靜脈置管，不進行窒息和CPR 操作；I/R 組和Cur+I/R 組構建CA/CPR 模型；Cur+I/R 組于CPR 開始前1 min 腹腔注射姜黃素（二甲基亞砜作為溶劑）100 mg/kg，同一時間Cur 組腹腔注射相同劑量姜黃素，Sham 組、I/R 組注射相同體積的二甲基亞砜。所有實驗動物相關操作均獲得大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗動物使用和管理委員會批準。

1.3 CA/CPR 模型的構建

采用窒息法建立大鼠CA/CPR 模型。術前12 h 禁食（不禁水），10%水合氯醛按0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉，將大鼠固定于手術臺上后給予氣管切開置管，接呼吸機。24G 留置針行股動脈、股靜脈插管監(jiān)測血壓，建立靜脈通路，心電監(jiān)護描記Ⅱ導聯(lián)心電圖，待大鼠血壓和心率穩(wěn)定后，于呼吸末夾閉氣管插管至心搏驟停。心臟停搏判定標準：心電圖呈心室纖顫（室顫）、停搏或無脈性電活動（PEA）波形，收縮壓<25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）[8]。心臟停搏5 min 后開放氣道，呼吸機機械通氣（通氣頻率80 次/min，潮氣量6 mL/kg，吸入氧濃度21%），并同時給予人工胸外按壓（按壓深度為胸廓前后徑的1/3，頻率為160 次/min），股靜脈快速推注腎上腺素（0.02 mg/kg）和5%碳酸氫鈉（1 mg/kg）， 持續(xù)監(jiān)測并記錄心電圖直至自主循環(huán)恢復（restoration of spontaneous circulation，ROSC）。ROSC 標準：心電圖出現正常QRS 波群；心前區(qū)觸及心臟搏動；平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP） >60 mmHg，并且至少維持5 min 以上。ROSC 后停止按壓，記錄時間，采集參數，大鼠血液循環(huán)穩(wěn)定后撤呼吸機，大鼠改為吸氧，連續(xù)監(jiān)測血流動力學。CPR 持續(xù)6 min 無效者放棄復蘇。

1.4 標本采集

ROSC 后6、12、24 h 尾靜脈采血1 mL，同時腹腔注射等體積生理鹽水，805×g 離心20 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱備用。ROSC 后24 h 處死大鼠，切取大鼠回腸2.5 cm（距回腸末端約8 cm），4 ℃生理鹽水中清洗后備用。

1.5 各項指標檢測方法

1.5.1 大鼠血清中TNF-α、IL-6 質量濃度的測定 取大鼠血清于4 ℃復融，檢測血清TNF-α、IL-6 的質量濃度，按照ELISA 試劑盒說明書操作。

1.5.2 大鼠腸組織MDA、GSH 含量及SOD 活力測定 取腸組織約100 mg 進行研磨，取組織勻漿，805×g離心20 min，取上清液，按照試劑盒說明，測定MDA、GSH 含量及SOD 活力。每個樣本重復3 次。

1.5.3 大鼠腸組織病理學分析 將腸組織于10%中性多聚甲醛溶液中固定，經過逐級乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，將組織塊切成4 μm 薄片，經脫蠟、水化、蒸餾水沖洗等，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色，在顯微鏡下觀察腸黏膜組織形態(tài)學變化情況。

1.5.4 腸黏膜上皮細胞凋亡檢測 取石蠟包埋腸組織切取3 μm 厚度的切片6 張，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS 沖洗，每片加25 μL TUNEL 反應液于37 ℃溫箱中孵育60 min。經PBS 沖洗，每片加25 μL 堿性磷酸酶抗體，于37 ℃溫箱中孵育10 ～30 min，再次PBS 沖洗，每片加1 ～2 滴底物顯色液BCIP/NBT，室溫下孵育30 min，PBS 沖洗。經蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察凋亡蛋白表達情況（凋亡細胞核呈棕色或棕黃色），于200 倍鏡下隨機選取5 個視野，計數每個視野中凋亡細胞數和總細胞數，以凋亡細胞數占總細胞數的百分比為凋亡指數（apoptotic index）。

1.5.5 Western blotting 檢測caspase-3 和HIF-1α 的表達 取 腸組織用裂解液RIPA 裂解，高速離心后提取回腸組織總蛋白。應用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）進行蛋白質分離，上樣后在12%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，以電轉膜方法將蛋白質轉移至醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入山羊抗大鼠caspase-3 和抗HIF-1α 的一抗（均1:200 稀釋）進行雜交，再用兔抗山羊HRP-IgG 二抗（1:500）標記，DAB 顯色。結果在圖像分析系統(tǒng)中進行分析。

1.5.6 腸黏膜上皮超微結構的觀察 取回腸標本（約1 mm3）固定于3%戊二醛的緩沖液中，PBS 沖洗后于1%四氧化鋨酸固定1 ～2 h。組織逐級乙醇脫水，樹脂包埋，常規(guī)超薄切片（厚度70 nm），用4%醋酸雙氧鈾和0.4%檸檬酸鉛固定，通過TEM 觀察黏膜上皮細胞及細胞間緊密連接的情況。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般生存狀態(tài)和復蘇后相關指標

4 組大鼠的術前呼吸頻率、心率、MAP 之間差異不明顯，均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。Cur+I/R 組與I/R組在模型構建過程中的窒息時間、腎上腺素用量、CPR至ROSC 時間相比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。Sham 組和Cur 組大鼠全部存活至術后24 h；I/R 組和Cur+I/R 組大鼠均復蘇成功，ROSC 后24 h 均僅各存活 5 只。4 組存活率之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表1）。

表1 各組大鼠的基線特征及模型構建過程中的相關指標Tab 1 Baseline characteristics of rats in each group and related indexes during model construction

2.2 血清中炎癥因子TNF-α、IL-6 的濃度

在ROSC 后6 h、12 h、24 h 檢 測 炎 癥 因 子TNF-α、IL-6 的濃度發(fā)現，Sham 組與Cur 組幾乎無變化，且2 組間 無 明 顯 差 異。Cur+I/R 組 和I/R 組 在6 h 時TNF-α 和IL-6 均處于高表達水平，隨著時間推移表達水平逐漸降低，但仍顯著高于Sham 組（均P<0.01）；Cur+I/R 組的TNF-α和IL-6 與I/R 組比較，均顯著降低（均P<0.05，圖1）。

圖1 大鼠ROSC 后不同時間血清中炎癥因子TNF-α 和IL-6 的濃度Fig 1 Concentrations of inflammatory factors TNF-α and IL-6 in rats serum in different periods after ROSC

2.3 腸組織中MDA、GSH 濃度及SOD 活力水平

通過檢測腸組織中MDA 濃度發(fā)現，Cur+I/R 組顯著低于I/R 組（P<0.05），但顯著高于Sham 組（P<0.01）；而Cur+I/R 組的SOD 活力和GSH 濃度顯著高于I/R 組（均P<0.05），低于Sham 組（均P<0.01，圖2）。

圖2 大鼠ROSC 后24 h 腸組織中MDA 和GSH 濃度及SOD 活力水平Fig 2 MDA and GSH concentrations and SOD activity 24 h after ROSC in intestinal tissues of rats

2.4 腸黏膜組織病理學變化

大鼠腸組織經H-E 染色后在鏡下觀察發(fā)現，I/R 組可見腸黏膜水腫，炎癥細胞浸潤，絨毛頂端上皮脫落、粘連，中央乳糜管擴張，固有層裸露、破潰；而Cur+I/R 組腸黏膜出現少量絨毛頂端上皮脫落，固有層輕度水腫，較I/R 組明顯減輕。Sham 組和Cur 組腸各層結構清晰，黏膜表層完整，腺體排列整齊（圖3）。

圖3 大鼠ROSC 后24 h 腸組織H-E 染色（×200）Fig 3 H-E staining results of intestinal tissues of rats 24 h after ROSC (×200)

2.5 腸黏膜上皮細胞凋亡情況

TUNEL 法檢測大鼠回腸黏膜顯示，Cur+I/R 組腸黏膜凋亡細胞多集中于缺血、缺氧敏感的腸絨毛的頂部， I/R 組腸黏膜上皮凋亡細胞呈棕褐色，在腸絨毛表面均有分布；Cur+I/R 組的凋亡指數較I/R 組顯著降低（P<0.05），但仍較Sham 組顯著升高（P<0.01）。Sham 組和Cur 組腸黏膜凋亡細胞較少（圖4）。

圖4 TUNEL 法檢測大鼠ROSC 后24 h 腸黏膜上皮細胞凋亡情況與凋亡指數（×200）Fig 4 TUNEL detection of intestinal mucosal epithelial cell apoptosis and apoptotic indexes of rats 24 h after ROSC (×200)

2.6 腸組織中caspase-3 和HIF-1α 的表達

Sham 組和Cur 組caspase-3 蛋白表達較低；Cur+I/R組caspase-3 蛋白表達顯著低于I/R 組（P<0.05），高于Sham 組（P<0.01）。Sham 組和Cur 組HIF-1α 蛋白表達較低；Cur+I/R 組HIF-1α 蛋白表達顯著高于I/R 組和Sham組（均P<0.05，圖5）。

圖5 Western blotting 檢測大鼠ROSC 后24 h 腸組織中caspase-3 和HIF-1α 蛋白表達Fig 5 Detection of caspase-3 protein expression in intestinal tissues of rats 24 h after ROSC by Western blotting

2.7 腸組織超微結構變化

TEM 下觀察，Sham 組腸黏膜上皮細胞排列緊密，細胞表面微絨毛豐富，排列有序，下方橋粒結構清晰，連接緊密，游離面細胞器豐富，有大量線粒體分布，細胞側面連接復合體結構完整；Cur 組上皮細胞呈高柱狀，表面微絨毛排列規(guī)則，橋粒結構清晰，特點與Sham 組相似；Cur+I/R 組腸黏膜上皮細胞微絨毛排列密集、有序，結構清晰，細胞間的連接復合體完整，細胞器形態(tài)大致正常；I/R 組腸黏膜上皮細胞微絨毛排列稀疏，欠規(guī)則，絨毛倒伏，彼此緊密連接的腸黏膜上皮結構被破壞，出現內質網脫顆?，F象，線粒體空化、嵴斷裂（圖6）。

圖6 TEM 下大鼠ROSC 后24 h 腸組織超微結構（×20 000）Fig 6 Ultrastructure of intestinal tissues of rats 24 h after ROSC under TEM (×20 000)

3 討論

臨床上CPR 的成功率近年來逐漸升高，但復蘇后的I/R 損傷及感染仍是死亡的主要原因，其中機制與腸道菌群失調、易位，炎癥因子、氧自由基及內毒素釋放導致腸黏膜上皮細胞凋亡及自主神經功能紊亂等密不可分[9-11]。CPR 后腸黏膜處于缺血再灌注狀態(tài)，絨毛頂端最敏感、易受損傷，可出現絨毛脫落、細胞變性壞死及黏膜損傷出血，腸道通透性增加，繼而細菌及其毒素移位至血液循環(huán)誘發(fā)膿毒癥甚至多臟器功能衰竭[12-14]。姜黃素是從姜科植物的根莖中提取的一種天然化合物，它可以抑制炎癥反應、降低活性氧簇、抑制巨噬細胞活性和蛋白激酶的表達，對機體組織炎癥損傷有著顯著的治療作用[15-19]。本實驗發(fā)現，ROCS 后I/R 組大鼠回腸黏膜水腫，炎癥細胞浸潤，絨毛頂端上皮脫落、粘連，上皮細胞結構損傷明顯，而Cur+I/R 組腸黏膜出現少量絨毛頂端上皮脫落，固有層輕度水腫，較I/R 組明顯減輕，說明姜黃素對大鼠CA/CPR 后腸上皮細胞具有一定保護作用。

TNF-α 是由單核巨噬細胞和活化的T 淋巴細胞分泌的早期炎癥因子和免疫調節(jié)因子，在腸道損傷炎癥級聯(lián)反應中起核心作用；IL-6 是二級炎癥反應介質的誘導物，能反映感染的嚴重程度及預后[20]。相關研究[8]表明，CPR后1 ～3 d，心、腦等重要器官功能逐步得到改善，而腸黏膜屏障損傷及血清中促炎介質TNF-α、IL-6、IL-8 等表達卻明顯增加，易繼發(fā)全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）， 進 而 出 現MODS。本實驗發(fā)現，CPR 后I/R 組6、12、24 h 血清中TNF-α 和IL-6 均呈高表達，提示受損腸黏膜存在持續(xù)炎癥反應，而Cur+I/R 組中TNF-α、IL-6 的水平明顯降低，表明姜黃素可抑制促炎因子的釋放。

在ROSC 后，微循環(huán)再灌注過程中產生大量氧自由基是器官損傷的重要環(huán)節(jié)。本研究顯示，I/R 組脂質過氧化產物MDA 含量顯著升高，而抗氧化應激相關的SOD 活力和GSH 含量明顯降低，說明ROSC 后腸黏膜上皮細胞存在著顯著的脂質過氧化現象，且清除氧自由基的能力明顯不足。而在姜黃素干預下CPR 后大鼠腸黏膜組織中MDA 含量下降，SOD 活力上升、GSH 含量上調，證實了姜黃素可通過清除氧自由基，抑制腸黏膜組織氧化應激反應，改善細胞內氧化還原狀態(tài)，從而保護腸黏膜免受過度氧化應激引起的損傷。

腸黏膜上皮細胞凋亡是ROSC 后腸道I/R 損傷的另一個重要因素[21-22]。本實驗發(fā)現，I/R 組TUNEL 染色后腸黏膜上皮和固有層細胞凋亡明顯增加，凋亡指數升高，以及凋亡蛋白caspase-3 的表達上調，均提示腸上皮細胞發(fā)生凋亡；而且TEM 下可見I/R 組腸上皮細胞內線粒體空化、嵴斷裂，以及脫顆?，F象。有研究[23-24]證實，姜黃素能通過上調腸上皮細胞中抗凋亡基因B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達，抑制caspase-3 的活化，從而減輕腸上皮細胞的凋亡程度。本研究結果顯示，Cur+I/R 組凋亡細胞數量減少，caspase-3 蛋白表達水平低于I/R 組，TEM 下可見腸黏膜上皮細胞損傷程度較I/R 組明顯減輕，說明姜黃素具有抑制CA/CPR 后腸上皮細胞凋亡、保護腸黏膜屏障的作用。

在CPR 過程中，腸黏膜作為缺氧敏感器官，往往是心臟停搏后缺血性損傷最早受累的部位。近年來，研究[25]表明，HIF-1α 作為低氧適應和病理反應中的一種特異性中介因子，在腸黏膜缺氧狀態(tài)下持續(xù)激活，其表達上調可產生一系列病理生理變化，從而修復和維持腸黏膜屏障功能。姜黃素在缺氧條件下可調節(jié)HIF-1α 活性[26-27]。在本實驗中Cur+I/R 組HIF-1α 活性明顯高于I/R 組，說明姜黃素可在ROSC 后24 h 的腸道內促HIF-1α 表達上升，對CPR后腸黏膜缺血給予保護性作用，而其中的機制尚未可知，需要在今后工作中進一步探索。

本實驗研究表明，姜黃素能有效減輕CA/CPR 后大鼠腸黏膜損傷，通過抑制炎癥介質釋放、清除氧自由基、抑制腸上皮細胞凋亡、上調HIF-1α 表達等方面對腸黏膜起保護作用，有望成為臨床上CPR 后患者保護腸道屏障功能的潛在藥物。但本研究樣本數量偏少，檢測炎癥及凋亡指標有限，這有待于下一步的研究中完善。

參·考·文·獻

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