趙艷娜，邱 榮，沈 南，唐元家

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院風(fēng)濕病科，上海市風(fēng)濕病學(xué)研究所，上海 200125；2.中國科學(xué)院大學(xué)上海營養(yǎng)與健康研究所，上海 200031

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為一個強大的基因組編輯工具，最早發(fā)現(xiàn)于細菌和古細菌中。它是細菌和古細菌在長期不斷進化的過程中產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫防御機制，用以保護自身的基因組免受外源核酸（如噬菌體、病毒等）的干擾和破壞[1]。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)主要由2 個部分組成：一是CRISPR 相關(guān)核酸酶，目前基因編輯系統(tǒng)中用到的主要是Cas9 核酸酶；二是小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA），含有20 nt 能夠與靶基因組互補的序列[2-3]。 Cas9 核酸內(nèi)切酶可以在sgRNA 的引導(dǎo)下對靶基因組DNA 進行切割，導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂[4]。在哺乳動物細胞中由CRISPR/Cas9 系統(tǒng)引起的雙鏈斷裂主要通過易錯的非同源末端連接（non-homologous end joining）機制修復(fù)，往往導(dǎo)致基因突變和功能喪失[5-6]，因此被廣泛應(yīng)用于各種疾病治療、基因功能鑒定、動物模型建立以及藥物研發(fā)[6]。然而，如何有效遞送CRISPR/Cas9 系統(tǒng)至目標(biāo)細胞及靶器官仍是該技術(shù)面臨的主要挑戰(zhàn)之一。

輔助性CD4 T 細胞在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。在免疫應(yīng)答過程中，初始CD4 T 細胞受到刺激后會分化成不同的效應(yīng)T 細胞亞群，包括輔助性T 細胞1（T helper cell 1，Th1）、輔助性T 細胞2（T helper cell 2，Th2）、輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17） 和調(diào)節(jié)性T 細胞（Regulatory T cells，Treg）[7]。不同的效應(yīng)T 細胞亞群在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著不同的功能。例如，Th17及其分泌的效應(yīng)細胞因子在宿主對抗各種感染（尤其是細胞外細菌感染）以及多種自身免疫疾病中發(fā)揮了重要作用[8]。Treg 細胞可以分泌轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β） 和 白 介 素-10（interleukin 10，IL-10）等抑制性細胞因子，不僅可以控制免疫耐受和免疫反應(yīng)強度，而且在避免組織炎癥損傷方面發(fā)揮重要作用[9]。因此，研究輔助性T 細胞的分化發(fā)育及其分子調(diào)控機制至關(guān)重要。

目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)的發(fā)展，使得對免疫細胞進行大規(guī)?；蜓芯砍蔀榭赡堋Ｈ鏢hifrut 等[10]利用慢病毒sgRNA 文庫和Cas9 蛋白，進行全基因組篩選影響人類T 細胞免疫反應(yīng)的調(diào)控分子。但目前現(xiàn)有的CRISPR/Cas9文庫大多基于慢病毒表達載體，很難感染小鼠T 細胞。因此，建立適合小鼠T 細胞基因功能研究的高通量篩選系統(tǒng)是亟待解決的問題。本研究構(gòu)建了sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒載體，結(jié)合Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠，研究影響Th17 分化的調(diào)控分子，為小鼠T 細胞功能研究提供工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 Rosa26-LSL-Cas9（024857）和CD4-Cre（022071）小鼠購自美國杰克森實驗室，飼養(yǎng)于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院SPF 級動物房[實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0002，使用許可證號SYXK（滬）2019-0001]，飼養(yǎng)溫度22 ～25 ℃，空氣相對濕度40%～60%。實驗獲中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號為201903H486）。

1.1.2 主要試劑 抗小鼠IL17A 抗體（PE anti-mouse IL-17A antibody，TC11-18H10.1；BioLegend，美國）；抗小鼠CD3e 抗體（145-2C11）、抗小鼠CD28 抗體（37.51）、抗小鼠γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）抗體（XMG1.2）、抗小鼠IL-4 抗體（11-B11；eBioscience，美國）；細胞固定/破膜試劑盒（BD Cytofix/Cytoperm ? Kit；BD Biosciences，美國），小鼠CD4 T 細胞分選試劑盒（Miltenyi，德國）；Xho1 內(nèi)切酶、Sal1 內(nèi)切酶、Taq DNA 聚合酶、NEBuider HiFi DNA Assembly Master Mix（NEB，美國）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基、RPM 1640、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco，美 國）；TGF-β1、IL-6（R&D， 美 國）；Lipo2000（Thermo Fisher Scientific， 美國），QIAamp DNA Mini Kit （Qiagen，中國）。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific， 美 國），Centrifuge 5417R 低溫高速離心機（Eppendorf，德國），DNA Thermal Cycler 9700 PCR 儀（Applied Biosystems；Thermo Scientific， 美國），凝膠圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad 3000，中國），普通光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），熒光顯微鏡（ZEISS，德 國），CytoFLEX LX 流 式 細 胞 儀（Beckman Coulter， 美國）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒表達載體 利用內(nèi)切酶Xho1 和Sal1 雙酶切MSCV-LTR-miR30-PIG（LMP）反轉(zhuǎn)錄病毒載體，回收大片段得到反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架。以慢病毒載體pKLV-U6-sgRNA 為模版設(shè)計PCR 引物，引物序列如表1。利用NEBuider HiFi DNA Assembly Master Mix將U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP 片段組裝進反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架。經(jīng)過轉(zhuǎn)化，挑克隆，測序得到正確載體。

表1 U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP 片段的PCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP PCR

1.2.2 sgRNA 設(shè)計和重組反轉(zhuǎn)錄病毒包裝 MIT CRISPR（http://crisp.mit.edu）網(wǎng)站設(shè)計sgRNA 序列，設(shè)計好的sgRNA 序列交由蘇州金唯智生物科技公司合成。用Plat-E包裝細胞產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒，使用Lipo2000 進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。以10 cm 培養(yǎng)皿為例，500 μLOpti-MEM 無血清培養(yǎng)基中加入20 μg sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒載體；另取500 μL Opti-MEM 加入40 μL Lipo2000，將前2 步所得混合液混勻。室溫放置15 min 后，加入培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染6 h 后細胞換液，48 h 后收集上清（病毒），0.45 μm 細胞濾網(wǎng)過濾后凍存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.3 T7E1 實驗驗證sgRNA 編輯效果 使用DNA 提取試劑盒提取細胞基因組DNA，Taq DNA 聚合酶進行PCR擴增。在Il17a sgRNA 靶向區(qū)域上下游設(shè)計引物，PCR 產(chǎn)物純化，取200 ng DNA 按照T7E1 實驗說明書進行操作。加入1 μL T7 核酸內(nèi)切酶，37 ℃反應(yīng)30 min，加入乙二胺四乙酸終止反應(yīng)。產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳。T7E1 引物見表2。

表2 T7E1 PCR 引物序列Tab 2 Primer sequences for T7E1

1.2.4 分離Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠CD4 T 細胞 分離Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟細胞，裂解紅細胞。按照小鼠CD4 T 細胞分選試劑盒說明書分離小鼠初始CD4 T 細胞。流式細胞儀檢測細胞純度（95%以上），進行后續(xù)實驗。

1.2.5 CD4 T 細胞體外激活培養(yǎng) CD3 和CD28 抗體包被在96 孔板，按照5 μg/mL 的終濃度加入抗小鼠CD3e抗體（145-2C11）和抗小鼠CD28 抗體（37.51），100 μL/孔包被96 孔板，并于4 ℃過夜。吸掉抗體懸液，加入200 μL 封閉液（PBS+ 1% FBS），于室溫封閉30 min，封閉結(jié)束加入200 μL PBS 洗滌2 次。分離得到CD4 T 細胞，按照細胞濃度1×106/mL 重懸。每孔加入200 μL 細胞，放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.6 反轉(zhuǎn)錄病毒感染和小鼠Th17 細胞誘導(dǎo)分化 小鼠CD4 T 細胞激活24 h 后進行反轉(zhuǎn)錄病毒的感染。以96孔板為例，準(zhǔn)備病毒和聚凝胺（polybrene，5 μg/mL）的混合液并吸取培養(yǎng)基上清液，加入病毒和polybrene 混合液；32 ℃、1 000 mL 離心90 min。離心結(jié)束后，棄去病毒上清液，加入Th17 分化培養(yǎng)基。Th17 分化培養(yǎng)基為1640 完全培養(yǎng)基并添加相應(yīng)細胞因子（mTGF-β1 1 ng/mL，mIL-6 10 ng/mL，抗小鼠IFN-γ 抗體10 μg/mL，抗小鼠IL-4 抗體10 μg/mL）。體外誘導(dǎo)3 d，進行后續(xù)檢測。

1.2.7 細胞因子刺激和檢測 小鼠Th17 細胞體外分化3 d 后，檢測細胞因子Il17A 表達水平。收集細胞前，用50 ng/mL 佛波酯、500 ng/mL 離子霉素和蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑刺激4 h。收集細胞，用BD 細胞因子染色試劑盒進行染色，流式細胞儀檢測。使用FlowJo 軟件（Becton Dickinson 10.0.7）進行流式數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過非配對t 檢驗 ，統(tǒng)計分析NC-sgRNA、Il17a-sgRNA、Irf4-sgRNA、Rorc-sgRNA 組sgRNA+Il17a+/sgRNA-Il17a+的數(shù)值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達載體

為了建立用于小鼠T 細胞基因功能研究的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，實驗構(gòu)建了反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達載體：用Xho1 和Sal1 雙酶切反轉(zhuǎn)錄病毒載體LMP，通過膠回收得到反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架；以慢病毒載體pKLV-U6-sgRNA為模版，通過PCR 擴增獲得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP 片段。利用同源重組將U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP 片段組裝進反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架得到反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達載體。在該載體中，U6 啟動子驅(qū)動sgRNA 表達，而PGK 啟動子驅(qū)動嘌呤霉素抗性基因（puromycin，Puro）和藍色熒光蛋白（blue fluorescent protein，BFP）表達（圖1）。

2.2 表達sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝和細胞感染

為了驗證新構(gòu)建的載體是否可以產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒，實驗對載體進行病毒包裝和細胞感染，結(jié)果見圖2。 病毒包裝細胞為Plat-E 細胞，只需要轉(zhuǎn)染反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒即可。轉(zhuǎn)染24 h 后，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，細胞形態(tài)正常。轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光顯微鏡下觀察到BFP的成功表達。為了驗證反轉(zhuǎn)錄病毒是否具有感染活性，實驗用產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒對NIH3T3 細胞進行感染。病毒感染48 h 后收集細胞，流式細胞儀檢測BFP 陽性細胞的情況，結(jié)果顯示BFP 陽性細胞比例為54.1%，說明反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達載體構(gòu)建成功并可產(chǎn)生有感染性的病毒顆粒，可用于后續(xù)實驗。

圖1 反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達載體構(gòu)建策略Fig 1 Construction strategy of retroviral sgRNA expression vector

圖2 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝和NIH3T3 細胞感染Fig 2 Retrovirus packaging and NIH3T3 cell infection

2.3 小鼠Th17 細胞體外分化系統(tǒng)建立

為了將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠Th17 細胞分化研究，實驗首先建立了Th17 細胞體外誘導(dǎo)分化系統(tǒng)。利用小鼠CD4 T 細胞分選試劑盒分離Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠初始CD4 T 細胞，流式細胞儀檢測結(jié)果表明細胞純度在95% 以上（圖3）。CD4 T 細胞鋪孔，觀察發(fā)現(xiàn)最先分離得到的小鼠CD4 T 細胞體積較小，呈圓形。經(jīng)過3 d 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細胞數(shù)目明顯變多，形態(tài)逐漸變成橢圓形或者條形。結(jié)果說明，實驗成功分離小鼠CD4 T 細胞并可以進行體外培養(yǎng)，可進行后續(xù)實驗。

圖3 小鼠Th17 細胞分化過程中的形態(tài)變化Fig 3 Morphological changes of mouse Th17 cells during differentiation

2.4 小鼠Th17 細胞中基因敲除

Th17 主要分泌Il17a 和Il17f 等促炎癥細胞因子，在自身免疫病發(fā)病中發(fā)揮作用，而Th17 的分化受到很多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Irf4、Rorc、Batf 等。為了驗證系統(tǒng)是否能用于基因敲除以及Th17 分化調(diào)控研究。實驗分別設(shè)計了靶向Il17a、Irf4、Rorc，以及NC 的sgRNA，并進行克隆和病毒包裝。分離Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠初始CD4 T 細胞，經(jīng)過CD3/28 抗體刺激24 h 后，進行反轉(zhuǎn)錄病毒感染。感染完成后，加入Th17 細胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化3 d，流式細胞儀檢測Th17 細胞內(nèi)Il17a 表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NC-sgRNA組中Il17a 陽性細胞在sgRNA+和sgRNA-2 個群體中的比例大致相等。而在Il17a-sgRNA 組中，Il17a 陽性細胞在sgRNA+群體較sgRNA-群體中的比例明顯降低。結(jié)果說明在Il17a 孔中，sgRNA+群體Il17a 基因被成功敲除。同樣 在Rorc 和Irf4 組 中，2 組sgRNA+群 體 和sgRNA-群體相比，IL17a 陽性細胞的比例明顯降低。結(jié)果說明2 組sgRNA+群體中Rorc 和Irf4 基因被成功敲除。為了減小孔間差異對結(jié)果偏差的影響，實驗進一步統(tǒng)計了同一個孔中sgRNA+組與sgRNA-組中Il17a 陽性細胞比例的比值，對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。對標(biāo)準(zhǔn)化后的比值進行統(tǒng)計分析（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC 組相比，Il17a、Rorc 和Irf4 組比值均顯著降低。以上結(jié)果說明，利用該系統(tǒng)可以成功進行基因敲除。

圖4 小鼠Th17 細胞中基因敲除Fig 4 Gene knockout in mouse Th17 cells

圖5 T7E1 實驗檢測Il17a 位點DNA 突變Fig 5 Detecting DNA mutations of Il17a locus by T7E1

2.5 T7E1 實驗檢測Il17a 位點DNA 突變

為了進一步驗證Il17a 基因組DNA 是否發(fā)生突變，實驗提取編輯后細胞基因組DNA。在Il17a-sgRNA 靶向位置上下游，設(shè)計引物進行PCR 擴增，進行后續(xù)T7E1 實驗。凝膠電泳結(jié)果顯示，在NC-sgRNA 組中，條帶完整未發(fā)生切割；而在Il17a-sgRNA 組中，條帶被切割成約380 bp 和180 bp 的2 個條帶，符合Il17a-sgRNA 靶向突變預(yù)期。結(jié)果表明，NC-sgRNA 組Il17a 基因未發(fā)生基因編輯；而Il17a-sgRNA 組IL17A 位點DNA 發(fā)生突變，Il17a 基因被敲除（圖5）。通過檢測基因組DNA 突變，進一步證明了系統(tǒng)的有效性。

3 討論

初始CD4 T 細胞在不同細胞因子的刺激下，會分化成不同的細胞亞群，如Th1、Th2、Th17 和Treg[11]。但不同分化亞群在介導(dǎo)疾病發(fā)生中發(fā)揮著不同的作用，如Th17細胞主要在自身免疫病以及炎癥中發(fā)揮重要作用，而Treg 細胞主要維持機體免疫穩(wěn)態(tài)從而抑制自身免疫病的發(fā)生[12]。因此，研究T 細胞分化調(diào)控，有助于更好地理解自身免疫病的發(fā)病機制。

近年來，很多新技術(shù)應(yīng)用于T 細胞分化的研究。Chen等[13]建立一套基于RNA 干擾體內(nèi)篩選系統(tǒng)，用以篩選淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）感染狀態(tài)下影響抗病毒CD4 和CD8 T 細胞分化的調(diào)控分子。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的發(fā)展，使得全基因功能篩選成為可能。Shalem 等[14]建立了全基因組篩選影響人類腫瘤細胞增殖的基因。Parnas 等[15]基于慢病毒載體的全基因組sgRNA 文庫和Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠進行了全基因組篩選，用于研究樹突狀細胞在受到細菌脂多糖刺激產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的調(diào)控分子。但是，由于Cas9 蛋白分子量大，很難包裝進病毒載體，限制了CRISPR/Cas9 在小鼠免疫細胞中的廣泛應(yīng)用。因此，實驗構(gòu)建了Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠。只需要構(gòu)建表達sgRNA 的病毒載體即可在小鼠T 細胞中進行基因功能研究。近年來，慢病毒載體由于能整合到宿主基因組DNA 穩(wěn)定遺傳，被廣泛應(yīng)用于sgRNA 遞送系統(tǒng)[16]。但是，慢病毒感染小鼠T 細胞效率較低，而且表達速度較慢[17]。所以實驗構(gòu)建了反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達載體用于小鼠T 細胞分化和基因功能 研究。

綜上，本研究利用反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達載體和Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠，成功在小鼠T 細胞中進行基因敲除，并將此系統(tǒng)應(yīng)用于Th17 細胞分化調(diào)控研究，驗證Rorc 和Irf4 是Th17 細胞分化中的關(guān)鍵調(diào)控分子。未來可以利用該系統(tǒng)構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 全基因組篩選文庫通量研究小鼠T 細胞分化調(diào)控分子，以期找到新的靶點。

參·考·文·獻

[1] Horvath P, Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea[J]. Science, 2010, 327(5962): 167-170.

[2] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science, 2012, 337(6096): 816-821.

[3] Garneau JE, Dupuis Mè, Villion M, et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA[J]. Nature, 2010, 468(7320): 67-71.

[4] Ran FA, Hsu PD, Lin CY, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity[J]. Cell, 2013, 154(6): 1380-1389.

[5] Hwang WY, Fu YF, Reyon D, et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 227-229.

[6] Jinek M, East A, Cheng A et al. RNA-programmed genome editing in human cells[J]. Elife, 2013, 2 (6121): e00471.

[7] Luckheeram RV, Zhou R, Verma AD, et al. CD4+T cells: differentiation and functions[J]. Clin Dev Immunol, 2012, 2012: 1-12.

[8] Ouyang WJ, Kolls JK, Zheng Y. The biological functions of T helper 17 cell effector cytokines in inflammation[J]. Immunity, 2008, 28(4): 454-467.

[9] Sharma A, Rudra D. Emerging functions of regulatory T cells in tissue homeostasis[J]. Front Immunol, 2018, 9: 883.

[10] Shifrut E, Carnevale J, Tobin V, et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function[J]. bioRxiv, 2018, 175 (7): 1958-1971 e1915.

[11] Zhu JF, Yamane H, Paul WE. Differentiation of effector CD4 T cell populations[J]. Annu Rev Immunol, 2010, 28(1): 445-489.

[12] Lee G. The balance of Th17 versus treg cells in autoimmunity[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(3): 730.

[13] Chen RQ, Bélanger S, Frederick MA, et al. In vivo RNA interference screens identify regulators of antiviral CD4+and CD8+T cell differentiation[J]. Immunity, 2014, 41(2): 325-338.

[14] Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells[J]. Science, 2014, 343(6166): 84-87.

[15] Parnas O, Jovanovic M, Eisenhaure TM, et al. A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks[J]. Cell, 2015, 162(3): 675-686.

[16] O'Keefe EP. Nucleic acid delivery: lentiviral and retroviral vectors[J]. Mater Methods, 2013, 3:174-177

[17] Baumann JG, Unutmaz D, Miller MD, et al. Murine T cells potently restrict human immunodeficiency virus infection[J]. J Virol, 2004, 78(22): 12537-12547.