梁俊林，顧國(guó)軍， 唐實(shí)玉，吳福忠，徐振鋒，譚 波，劉 洋*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院生態(tài)林業(yè)研究所，長(zhǎng)江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2.四川省阿壩藏族羌族自治州川西林業(yè)局，四川理縣 623102）

銀杏（Ginkgo biloba L.），屬于落葉喬木，樹(shù)冠廣卵形，最高可達(dá)40 m，胸徑可達(dá)4 m，銀杏是我國(guó)的特產(chǎn)世界著名園林樹(shù)種，是稀有的孑遺樹(shù)種。銀杏樹(shù)形優(yōu)美，葉形也富有特點(diǎn)，像一把扇子，春夏季為嫩綠色，入秋葉色金黃，其葉色變色較晚，落葉遲，起到很好的觀賞的作用，所以常作庭蔭樹(shù)、行道樹(shù)或孤植樹(shù)[1-2]。如今，城市中對(duì)銀杏的應(yīng)用非常廣泛，許多城鎮(zhèn)中都有銀杏大道，到了秋季，也成為吸引游客的重要風(fēng)景線(xiàn)。銀杏在園林綠化、旅游等方面都具有重要的價(jià)值。銀杏在自然條件下，隨著秋季的到來(lái)，葉色由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，葉色轉(zhuǎn)變的直接原因是細(xì)胞內(nèi)色素含量的增減變動(dòng)，以此引發(fā)了色素的相對(duì)含量變化，葉色由綠色轉(zhuǎn)為非綠色，就是由于葉綠素的相對(duì)含量降低，植物體內(nèi)可溶性糖以及相關(guān)酶類(lèi)等生理指標(biāo)分別不同程度的影響著色素的合成與分解[3-5]，從而影響植物葉片的呈色。

不同植物葉片呈現(xiàn)出不同的顏色，這是和葉片細(xì)胞內(nèi)色素的種類(lèi)、相對(duì)含量密切相關(guān)[6]。一般植物葉片表現(xiàn)為綠色，這是由于葉片中葉綠素（Chl）的相對(duì)含量多于類(lèi)胡蘿卜素[7]，葉綠素是植物重要的光合色素，植物通過(guò)葉綠素捕獲光子，并將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[8]，因此葉綠素在植物體內(nèi)扮演者重要的角色。葉片顏色從綠色變?yōu)槠渌伾?，原因之一就是葉綠素相對(duì)含量減少，而Caro 相對(duì)含量增加。T.A.Shemer 等[9]對(duì)果實(shí)進(jìn)行研究，認(rèn)為顏色轉(zhuǎn)變常常會(huì)有大量Caro 的合成和大量葉綠素的分解。而催化葉綠素分解的第一步酶就是葉綠素酶[10]，有學(xué)者認(rèn)為，在葉片衰老的期初階段，葉綠素酶發(fā)揮作用可能是在Chlb 轉(zhuǎn)化為Chla 的過(guò)程中[11]。葉綠素酶對(duì)葉綠素進(jìn)行分解，導(dǎo)致其相對(duì)含量下降，葉片逐漸褪綠?；ㄉ剀帐乔锛救~色轉(zhuǎn)變的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，由花色素與糖組成，主要在植物表皮細(xì)胞的液泡中，也是彩葉植物葉色多彩的主要物質(zhì)[12]。M.Landi 等[13]認(rèn)為花色素苷對(duì)植物葉片起著一定的保護(hù)作用，其含量的積累可能會(huì)延緩葉面衰老。關(guān)于花色素苷的合成，要具備兩個(gè)要求，首先要有相關(guān)基因，其次要有適宜的環(huán)境信號(hào)的刺激讓相應(yīng)基因進(jìn)行表達(dá)[14]。J.T.Matu 等[15]在做葡萄的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，葡萄中花色素苷的積累是由于特定的品種和環(huán)境誘導(dǎo)，這一結(jié)論更證明了花色素苷合成所需的條件。Oren-Shemer 等[16]進(jìn)行環(huán)境溫度對(duì)花色素苷合成影響的研究中發(fā)現(xiàn)，一定的低溫可以誘發(fā)黃櫨中花色素苷的合成；現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者也對(duì)有關(guān)花色素苷合成的基因進(jìn)行了研究[15，17-19]。對(duì)花色素苷的研究，主要集中于水果和蔬菜方面，對(duì)園林景觀植物中的花色素苷的研究相對(duì)較少。銀杏作為一種重要的城市綠化和景觀樹(shù)種，研究葉片顏色變化過(guò)程中的生理指標(biāo)，為揭示其秋季變色的生理機(jī)制及其園林綠化管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)（30°42' N，103°51' E），屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年平均氣溫15.9 ℃，絕對(duì)最高氣溫35.5 ℃，絕對(duì)最低氣溫-5.4 ℃，無(wú)霜期271 d，年平均日照率為32%，日照100 d，多年平均降水量972 mm，年平均相對(duì)濕度84%[20]。

1.2 樣品采集與處理

本試驗(yàn)于2017 年9—11 月每月中旬進(jìn)行采樣。9 月中旬，校園銀杏葉色為微黃，選擇校區(qū)內(nèi)銀杏大道兩側(cè)健康、無(wú)病害、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的5 棵植株，每棵樹(shù)上采集完整的向陽(yáng)葉至少100 片。于早上9 點(diǎn)進(jìn)行采樣，裝入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室洗去葉表面的污垢，在濾紙上擦干。然后每棵樹(shù)的葉片混勻、剪碎作為一個(gè)待測(cè)樣品，進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。10月中旬，銀杏葉黃色加深，11 月中旬，葉色變?yōu)槿S，重復(fù)上述步驟進(jìn)行采樣。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 色素含量

參照熊慶娥等[21]的方法。稱(chēng)取剪碎新鮮葉片，提取72 h 后，于663 和646 nm 處比色，類(lèi)胡蘿卜素在470 nm 比色。

葉綠體色素的含量（mg/g）=N×Vt×C/W

C 為色素的濃度（mg/L）；Vt為提取液體積（mL），N 為稀釋倍數(shù)，W 為樣品鮮重（g）。

1.3.2 花色素苷（Anthocyanin）含量

參照A.Pirie 等[22]的方法。稱(chēng)取剪碎新鮮葉片，加入1%鹽酸甲醇溶液，于32 ℃恒溫水浴鍋中浸提，測(cè)定530 和657 nm 處的吸光值。

花色素苷的含量（mg/g）=（OD530-0.25×OD657）/0.1

1.3.3 葉綠素酶（Chlase）活性

參照李遠(yuǎn)華等[23]的方法。稱(chēng)取剪碎新鮮葉片，研磨，置于-20 ℃提取40 min，離心，去除上清液，對(duì)底部沉淀再用同樣條件重復(fù)提取2 次。在沉淀中加入5 mM pH=7 的磷酸緩沖液3 mL，上清液為酶粗提液。反應(yīng)體系于黑暗條件下反應(yīng)40 min，終止反應(yīng)，離心5 min，在667 nm 下測(cè)定吸光值。

葉綠素酶活力[μmol/（g·min）]=OD×Vt×N×103/（54.1×W×Vs× t）

Vt為提取酶液總體積（mL），N 為稀釋倍數(shù)，W為相品鮮重（g），Vs為測(cè)定時(shí)的酶液用量（mL）。

1.3.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

稱(chēng)取剪碎的新鮮葉片，研磨，離心，上清液為待測(cè)酶液。反應(yīng)體系中加入TCA 終止反應(yīng)，在290 nm處測(cè)定OD 值，以每分鐘在290 nm 處吸光值變化0.01 所需要的酶量為一個(gè)單位，酶活單位以U/g 表示。

苯丙氨酸解氨酶活性[U/（min·g）]=（ΔOD×Vt）/（Vs×W×0.01t）

Vs為測(cè)定時(shí)的酶液用量（mL），Vt為提取酶液總體積（mL），W 為樣品重（g），ΔOD 為 30 min 內(nèi)吸光度的差值。

1.3.5 可溶性糖（SS）含量

參照劉新等[24]的方法。取剪碎的新鮮葉片，研磨，離心，上清液為樣品提取液。反應(yīng)體系沸水浴10 min，取上清液測(cè)定在 450、532 和 600 nm 波長(zhǎng)下的吸光值。

可溶性糖含量（μmol/g）=（11.71A450V×Vt）/（W×Vs×1 000）

V 為反應(yīng)液體積（mL），Vt為提取液總體積（mL），W 為鮮重（g），Vs為測(cè)定時(shí)加樣量（mL）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL 2003 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以及圖表的制作。使用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用最小顯著差異法（LSD）比較不同葉色之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素含量的變化

由表1 可知，銀杏葉中的Chla、Chlb、Chl（a+b）和Caro 的含量隨著葉色逐漸變黃都逐漸降低，葉色從微黃向中黃轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，表現(xiàn)為極顯著的降低（P＜0.001）。整個(gè)過(guò)程中，Chl（a+b）下降趨勢(shì)最為顯著，微黃極顯著高于中黃（P＜0.001），中黃極顯著高于全黃（P＜0.001），從 3.999 mg/g 降到 0.077 mg/g，降低了96%；Caro 下降趨勢(shì)最緩，從圖1 得出，其相對(duì)含量卻在逐漸升高，分別約為23%、36%和84%；Chlb 相對(duì)含量在整個(gè)葉色變化中都是最少的，分別約為16%、13%和6%。葉微黃時(shí)，色素含量在不同葉色中都是最高的，此時(shí)Chla 含量最多，為3.188 mg/g；葉全黃時(shí)，色素含量在不同葉色中都為最低，此時(shí)Caro 含量最多，為 0.403 mg/g。

表1 銀杏色素含量隨著葉色改變的變化情況（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 1 Changes of Ginkgo pigment L.contents with change of leaf color （mean±standard deviation）

圖1 類(lèi)胡蘿卜素、葉綠素b 和葉綠素a 分別占總色素的相對(duì)比例Figure 1 The relative proportion of carotenoids，chlorophyll b and chlorophyll a in total pigments

2.2 花色素苷（Anthocyanin）含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的變化

從圖2 中可以看出，花色素苷含量和PAL 活性變化趨勢(shì)相反，花色素苷含量隨著葉色的變黃而逐漸增加，PAL 活性隨著葉色的變黃卻逐漸降低。葉微黃時(shí)，PAL 活性最高，極顯著高于葉中黃和全黃（P＜0.001），隨著PAL 活性逐漸降低，花色素苷含量增加的趨勢(shì)?；ㄉ剀罩悬S時(shí)顯著高于微黃（P＜0.05），中黃和全黃時(shí)的含量差異不顯著（P＞0.05），可以看出花色素苷的合成與PAL 活性關(guān)系不大。

圖2 花色素苷（Anthocyanin）含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的轉(zhuǎn)變Figure 2 Changes in anthocyanin content and L-phenylalanin ammonia-lyase activity

2.3 葉綠素酶（Chlase）活性和可溶性糖（SS）含量的變化

由圖3 可以看出，葉綠素酶活性隨著葉色的轉(zhuǎn)變，呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，葉色中黃時(shí)活性最高，達(dá)到4.181 μmol/（min·g），極顯著高于葉微黃和全黃（P＜0.001）；全黃時(shí)其活性最低，顯著低于葉中黃，降低了約78%。SS 含量的變化都隨著葉黃色的逐漸加深而逐漸增多，雖然SS 含量逐漸增加，但是遞增緩慢，葉色微黃和中黃之間沒(méi)有顯著的差異（P＞0.01），只有全黃時(shí)的含量顯著高于微黃和中黃（P＜0.01）。由圖可以看出可溶性糖與花色素苷呈正相關(guān)的關(guān)系，說(shuō)明可溶性糖促進(jìn)花色素苷的合成。

圖3 葉綠素酶（Chlase）活性和可溶性糖（SS）含量的變化Figure 3 Changes inchlase activity andsoluble sugar content

3 討論與結(jié)論

葉片顏色的轉(zhuǎn)變主要是由葉片中色素種類(lèi)和相對(duì)含量發(fā)生變化導(dǎo)致的[25-27]。Caro 可以減輕葉綠素被光氧化的現(xiàn)象，起著輔助性光合色素的作用，并且可以使葉片呈現(xiàn)黃色或橙色[28]。本試驗(yàn)中，當(dāng)銀杏葉從微黃轉(zhuǎn)變?yōu)槿S的過(guò)程中，葉綠素相對(duì)含量降低，這與榮立蘋(píng)、陳繼衛(wèi)、胡敬志等[3，29-30]對(duì)雞爪槭和楓香變色期間葉綠素含量變化的研究結(jié)果一致，葉綠素相對(duì)含量降低，葉片逐漸失綠，呈現(xiàn)出紅色或者黃色。而Caro 穩(wěn)定不易被降解，所以降解速率較緩，導(dǎo)致相對(duì)含量升高，韓玲玲等[31]對(duì)海棠葉色變化的研究中也得出這一結(jié)論，隨著Caro 相對(duì)含量的增加，海棠葉慢慢變黃，由此可以看出，Caro 相對(duì)含量的升高是引起銀杏葉的變黃的一個(gè)重要因素。而葉綠素酶是參與葉綠素降解的酶[32]，Chen M.等[33]發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)雜色植物中，非綠色部分的葉綠素酶活性高出綠色部分，表明葉綠素的多少與葉綠素酶的活性緊密相關(guān)。本試驗(yàn)中，銀杏葉色從微黃到中黃，葉綠素酶活性增高，中黃時(shí)達(dá)到最大活性，在此期間，葉綠素含量急劇下降，尤其是Chla 的含量變化最大，下降了77%，葉綠素酶活性增大，加快了葉綠素的分解，尤其是對(duì)Chla 的分解，使得Chla 含量急劇減少；中黃到全黃時(shí)，葉綠素酶活性減小，使得葉綠素被分解的速率減小，含量下降速率變緩。由此說(shuō)明葉綠素酶活性與葉綠素的分解呈正相關(guān)。

花色素苷是彩葉植物主要色素之一，合成后的花色素苷在液泡中被包裹成色素體[26]。T.Tusda 等[34]等研究發(fā)現(xiàn)花色素苷具有一定的抗氧化能力，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的花色素苷能夠抑制膜過(guò)氧化，清除自由基，周丹蓉等[35]對(duì)李果皮的研究中也得出這一結(jié)論。本試驗(yàn)中，隨著花色素苷的逐漸積累，葉綠素和Caro 逐漸減少，而Caro 和花色素苷的相對(duì)含量逐漸增大，這與呂秀立、姜琳等[4,36]對(duì)櫟樹(shù)的研究結(jié)果一致，在櫟樹(shù)葉片發(fā)生變化的這一過(guò)程中，也伴隨著花色素苷的積累，Caro 的相對(duì)含量增加這一現(xiàn)象。由此可以看出，銀杏葉變色是由于花色素苷和Caro共同作用的結(jié)果，與鄭恬靜[37]對(duì)海棠的研究結(jié)論相一致。從試驗(yàn)結(jié)果看出，PAL 不是銀杏合成花色素苷的關(guān)鍵酶。但花色素苷與SS 的關(guān)系密切，兩者變化趨勢(shì)基本一致。植物體內(nèi)的SS 不僅為信號(hào)物質(zhì)，還是能量來(lái)源，更影響著植物的抗凍能力。張瑞粉、楚愛(ài)香等[38-39]認(rèn)為SS 是合成花色素苷的前提物質(zhì)，因此SS 積累增加可以促進(jìn)花色素苷的合成。本試驗(yàn)中，從銀杏葉微黃到全黃過(guò)程中，SS 含量增高，花色素苷逐漸積累，陳繼衛(wèi)等[5]在研究紅楓轉(zhuǎn)色期生理時(shí)，也發(fā)現(xiàn)在紅楓顏色轉(zhuǎn)變過(guò)程中，SS 和花色素苷含量都在增加，說(shuō)明隨著氣候的變化，銀杏葉為了適應(yīng)環(huán)境，抗凍性逐漸增強(qiáng)，同時(shí)SS 促進(jìn)了花色素苷的合成，銀杏葉逐漸變黃。綜上，銀杏葉變色的直接原因是銀杏葉片中色素含量發(fā)生變化，Caro 和花色素苷的相對(duì)含量增加，由于葉綠素酶對(duì)葉綠素的分解，致使葉綠素相對(duì)含量減少，葉片逐漸褪綠，呈現(xiàn)出黃色。自然環(huán)境下，銀杏葉變色還伴隨著銀杏抗逆基質(zhì)的啟動(dòng)，如抗逆物質(zhì)SS 的合成，葉色變化是一個(gè)綜合作用的結(jié)果。本研究為銀杏的秋色葉變色機(jī)理研究、提高園林綠化管理提供科學(xué)依據(jù)，但是引起其變色的基因水平還有待進(jìn)一步的深入研究。