劉夢(mèng)涵 熊結(jié)青 楊儒文

摘 ? ? ?要：主要論述了麩皮培養(yǎng)基中不同淀粉含量對(duì)產(chǎn)黑曲霉孢子的速度、質(zhì)量、數(shù)量的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，麩皮培養(yǎng)基中的淀粉含量能夠提高黑曲霉菌絲生長(zhǎng)速度，但是不利于黑曲霉產(chǎn)孢速度。麩皮培養(yǎng)基中的淀粉含量對(duì)麩曲孢子數(shù)量及孢子質(zhì)量沒(méi)有影響，培養(yǎng)基中的水分及氮源含量，影響黑曲霉孢子的著生，對(duì)麩曲孢子總數(shù)影響顯著。

關(guān) ?鍵 ?詞：淀粉;黑曲霉;孢子;質(zhì)量;產(chǎn)量

中圖分類號(hào)：TQ 016.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ?文章編號(hào)： 1671-0460（2020）02-0357-04

Abstract： The effect of different starch content in bran medium on the yield， quality and quantity of aspergillus Niger spores was investigated. The results showed that high starch content in bran medium could improve the growth rate of aspergillus niger， but could restrain the sporulation rate of aspergillus niger. The content of starch in the bran medium had no effect on the number and quality of spores， while the content of water and nitrogen in the medium affected the initiation of aspergillus Niger spores and the total number of spores.

Key words： Starch; Aspergillus niger; Spores; Quality; Production

檸檬酸是有機(jī)酸中第一大酸，由于該產(chǎn)品具有物理、化學(xué)等方面的性能。檸檬酸廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，也可應(yīng)用于醫(yī)藥、電子、化學(xué)、石油、皮革、紡織、建筑等各個(gè)領(lǐng)域[1，2]。我國(guó)是檸檬酸生產(chǎn)大國(guó)，截止2018年產(chǎn)量已達(dá)177萬(wàn)t，2010-2015年均增長(zhǎng)率為2.9%;表觀消費(fèi)量從2010年的104萬(wàn)t增長(zhǎng)到2015年的118萬(wàn)t，年均增長(zhǎng)率為2.6%，出口占60%。

檸檬酸發(fā)酵通常用黑曲霉二級(jí)發(fā)酵的方式，即先培養(yǎng)大量的成熟孢子，再將成熟的孢子做成孢子懸浮液，接入種子罐培養(yǎng)，種子罐培養(yǎng)合格后再接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。黑曲霉孢子制備過(guò)程比較復(fù)雜。合格的黑曲霉菌種需要經(jīng)過(guò)分離、篩選，選育出高產(chǎn)菌株，然后再進(jìn)行斜面培養(yǎng)，最后再進(jìn)行三角瓶逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備過(guò)程繁瑣，工作量大，從菌種選育到合格的成熟麩曲，制備周期至少需要30 d以上[1]。

所以黑曲霉孢子質(zhì)量、產(chǎn)量是保證檸檬酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。而營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響是大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸的前提。碳源、氮源、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是黑曲霉種子生長(zhǎng)的所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量來(lái)源[3]。

作為微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它能夠在細(xì)胞外或者直接被水解成小分子物質(zhì)，通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后，在胞內(nèi)酶的作用下，經(jīng)過(guò)化學(xué)變化后組成細(xì)胞的原生質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成物質(zhì)，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量[4]。

麩皮中淀粉含量豐富，淀粉是大多數(shù)微生物可以利用的碳源物質(zhì)，可以為黑曲霉生長(zhǎng)提供足夠的碳源。通常生產(chǎn)用水淘洗至淀粉含量極低的麩皮作為黑曲霉產(chǎn)孢的培養(yǎng)基。

麩皮作為黑曲霉產(chǎn)孢培養(yǎng)基具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：（1）天然基質(zhì)，不僅淀粉含量豐富，其他氮源等他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也非常豐富; （2） 麩皮價(jià)格低廉，投資少;（3）麩皮作為黑曲霉產(chǎn)孢的載體，表面積大，孢子附著量多，利于增加黑曲霉產(chǎn)孢量。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

試驗(yàn)儀器設(shè)備

試驗(yàn)所需的儀器設(shè)備見(jiàn)表1所示。

1.2 ?試驗(yàn)菌種

本試驗(yàn)使用的菌種由中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司提供。

1.3 ?試驗(yàn)原輔材料

糖化酶、玉米粉、麩皮、a-淀粉酶（耐高溫）、等材料均由中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司提供。

1.4 ?試驗(yàn)方法

1.4.1 ?PDA平板制備

取200 g去皮土豆，切成1 cm方塊的小丁，加1 000 mL水，水浴鍋內(nèi)煮沸，500 W條件下，保持30 min。紗布過(guò)濾后，冷卻備用[5]。

在1 000 mL土豆汁中添加20 g葡萄糖，18g瓊脂粉，水浴鍋內(nèi)溶解，待瓊脂完全溶解后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌121 ℃×20 min。滅菌結(jié)束后取出冷卻至50 ℃左右，在無(wú)菌凈化臺(tái)上倒平板。待平板凝固后放入35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中空白培養(yǎng)48 h，檢查無(wú)染菌后，備用[3]。

1.4.2 ?搖瓶培養(yǎng)基制備

按照25%玉米粉調(diào)漿， 添加2%α-淀粉酶，攪拌均勻后放在水浴鍋中，95 ℃條件下，液化大約2 h，碘試不變藍(lán)即為液化合格。取部分的液化液不過(guò)濾，再取一部分液化液用濾布過(guò)濾出清液，再將液化液、液化清液按照一定比例混合，檢測(cè)混合液總糖。按照每瓶40 mL裝液量分裝搖瓶，不補(bǔ)水。121 ℃×20 min條件下滅菌[6]，備用。

1.4.3 ?麩皮培養(yǎng)基制備

取過(guò)16目篩的新鮮大片麩皮，按麩皮∶水=1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入自來(lái)水（單位質(zhì)量，淀粉含量由高到低），拌勻至無(wú)干粉又無(wú)結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。作為對(duì)照的麩皮淘洗至水清、水分控制在70%左右。分別將上述不同配方的培養(yǎng)基分裝至1 000 mL三角瓶?jī)?nèi)，每種配方分裝6瓶，每瓶裝培養(yǎng)基45 g左右。分裝后的三角瓶棉塞塞上后用牛皮紙包扎。0.15 MPa，121 ℃條件下，滅菌60 min。滅菌后的麩皮，由于含有淀粉，容易結(jié)塊。所以待麩皮培養(yǎng)基冷卻后，將結(jié)塊的麩皮進(jìn)行打散，備用。

不同配方培養(yǎng)基中淀粉含量檢測(cè)情況見(jiàn)表2。

1.5 ?接種

在無(wú)菌室內(nèi)，無(wú)菌凈化臺(tái)上，火焰下方，每一瓶麩皮培養(yǎng)基分別接入1-2環(huán)黑曲霉孢子，接種量控制相同。

1.6 ?培養(yǎng)

接種后的三角瓶，放置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)箱溫度設(shè)定35～37 ℃、濕度40%～60%。培養(yǎng)24 h后麩皮培養(yǎng)基表面開(kāi)始長(zhǎng)出白色小菌落，布滿麩皮表層，這時(shí)開(kāi)始翻曲一次，使培養(yǎng)基疏松、透氣，并鋪平瓶底。繼續(xù)培養(yǎng)，以后，每隔12 h翻曲。麩曲生長(zhǎng)至36～48 h，白色菌絲生長(zhǎng)達(dá)到生長(zhǎng)旺盛期，此時(shí)產(chǎn)生熱量最大，麩曲結(jié)塊比較嚴(yán)重。如果此時(shí)不及時(shí)翻曲，容易造成燒曲[6]。所以，36～48 h期間，翻曲的時(shí)候，一定要將結(jié)塊打散，并將麩曲平鋪瓶底。

此階段沒(méi)有產(chǎn)生孢子。當(dāng)麩曲培養(yǎng)到48 h以后，開(kāi)始產(chǎn)生零星孢子，72 h開(kāi)始布滿整個(gè)三角瓶，此時(shí)翻曲停止。繼續(xù)培養(yǎng)至10 d左右，孢子成熟后即可進(jìn)行下步試驗(yàn)。

1.7 ?孢子計(jì)數(shù)

1.7.1 ?配制0.2%吐溫溶液

吸管吸取2 mL吐溫-80加入1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1 000 mL，加入轉(zhuǎn)子在磁力攪拌器上攪勻。

1.7.2 ?洗孢子

用量筒量取上述200 mL吐溫溶液在通風(fēng)櫥中輕輕地沿瓶壁倒入被測(cè)麩曲瓶中，充分搖勻，用紗網(wǎng)過(guò)濾。再用200 mL吐溫溶液逐步清洗過(guò)濾后的麩皮上的孢子，直至麩皮洗白既可。將洗好的孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌均勻。

1.7.3 ?稀釋

取上述孢子懸浮液4 mL于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入純凈水定容至100 mL。將稀釋后的孢子懸浮液放在超聲清洗機(jī)內(nèi)超聲10 min。

1.7.4 ?孢子計(jì)數(shù)

血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的，帶有網(wǎng)格的特殊載玻片，載玻片上有4個(gè)槽組成3個(gè)平臺(tái)。其中中間被一短槽分成兩個(gè)部分，每部分上面各刻有方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)總共有九個(gè)大格，中間的一大格作為計(jì)數(shù)用，叫計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)的刻度分為有兩類：一類是計(jì)數(shù)區(qū)為16個(gè)大方格，而每個(gè)大方格又被分成25個(gè)小方格（一般稱為16×25）;另一類是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)是25個(gè)大方格，而每個(gè)大方格又被分成16個(gè)小方格（一般稱為25×16）。

目前使用的血球計(jì)數(shù)板規(guī)格為25×16。計(jì)數(shù)區(qū)總共有400個(gè)小方格，計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)1 mm，計(jì)數(shù)區(qū)的面積為l mm2，所以每個(gè)小方格的面積為1/400 mm2。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1 mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1 mm3，每個(gè)小方格的體積為1/4 000 mm3。

取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片，先沾少量水使蓋玻片固定在血球計(jì)數(shù)板上。

將孢子懸浮液搖勻，用膠頭滴管吸取少量，從計(jì)數(shù)板平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)快速滴入一小滴（孢子容易沉淀，滴定時(shí)一定要快速，而且滴定量不宜過(guò)多），讓孢子懸浮液利用液體表面張力填滿計(jì)數(shù)區(qū)，不要有氣泡產(chǎn)生，并用濾紙吸去溝槽中溢出的多余孢子懸浮液。

靜置片刻，待孢子沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體移動(dòng)。將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，并夾穩(wěn)，先在150倍顯微鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換600倍顯微鏡觀察，調(diào)整粗細(xì)螺旋，視野清晰，開(kāi)始計(jì)數(shù)。

選擇處于4個(gè)角上的4個(gè)方格和中間的一個(gè)方格（每個(gè)大方格中有16個(gè)小方格），計(jì)數(shù)，數(shù)得5個(gè)大方格中的孢子總數(shù)N1。

重復(fù)上述，操作5次，又可分別得到孢子總數(shù)、N2、N3、N4、N5、N6。

計(jì)算：

孢子總數(shù)（個(gè)）=（N1 + N2 + N3 + N4 + N5 + N6）×400×10 000×25×400/（6×80）或 5個(gè)大格總數(shù)×5×10 000×稀釋倍數(shù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同淀粉含量對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響

黑曲霉屬于半只菌綱，只進(jìn)行無(wú)性繁殖即由孢子發(fā)芽開(kāi)始到新孢子形成、成熟為一個(gè)生活周期。黑曲霉孢子在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)，6～8 h開(kāi)始出芽，逐漸形成菌絲，進(jìn)一步形成菌球。但是，黑曲霉孢子在固體培養(yǎng)基上，也是先出芽，長(zhǎng)出很多芽，逐漸長(zhǎng)成菌絲。很快，菌絲開(kāi)始分枝。由于黑曲霉菌絲有橫隔，是多細(xì)胞結(jié)構(gòu)[7]。當(dāng)足細(xì)胞長(zhǎng)出分生孢子梗時(shí)，梗的頂端泡囊開(kāi)始聚集，并與原生質(zhì)膜融合，使頂端逐漸膨大形成頂囊。頂囊上面長(zhǎng)出二層小梗，接著小梗上長(zhǎng)出成鏈的孢子。這樣，黑曲霉菌絲就不斷生長(zhǎng)，孢子也就不斷產(chǎn)生，直至培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)耗盡為止[5，8]。

本次試驗(yàn)中，觀察黑曲霉生長(zhǎng)狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)84 h以前，淀粉含量高的麩皮培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)快且菌絲長(zhǎng)，84 h以后淀粉含量低的培養(yǎng)基孢子產(chǎn)生快。分析認(rèn)為，在每克培養(yǎng)基中，淀粉含量高的麩皮培養(yǎng)基中，碳源含量豐富，可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供足夠的能量，可以促進(jìn)黑曲霉菌絲生長(zhǎng)，但是由于本試驗(yàn)中淀粉含量高的培養(yǎng)基結(jié)團(tuán)嚴(yán)重，通氣性差，不利于黑曲霉孢子著生，所以淀粉含量高可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)但是對(duì)產(chǎn)孢子速度不利。

2.2 ?不同淀粉含量對(duì)黑曲霉的孢子的影響

采用血球計(jì)數(shù)板方法計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，淀粉含量15.56%配方的孢子數(shù)最少，淀粉含量13.36%配方的孢子數(shù)最多，淀粉含量9.26%配方的孢子數(shù)最少。初步分析，孢子數(shù)最多的配方培養(yǎng)基中，不僅淀粉含量高達(dá)15.56%（干基）。由于培養(yǎng)基中淀粉含量過(guò)多，導(dǎo)致培養(yǎng)基淀粉結(jié)團(tuán)嚴(yán)重，導(dǎo)致黑曲霉生長(zhǎng)過(guò)程中結(jié)塊不易打散，產(chǎn)生的熱量不能散發(fā)出去，導(dǎo)致黑曲霉燒曲嚴(yán)重，進(jìn)而影響黑曲霉產(chǎn)孢量。而淀粉含量13.36%的配方孢子數(shù)最多，初步分析，此時(shí)培養(yǎng)基中的淀粉含量即碳源含量能夠滿足黑曲霉生長(zhǎng)，而且由于淀粉含量較低，培養(yǎng)基疏松，不易結(jié)團(tuán)，而且利于黑曲霉代謝產(chǎn)生的熱量散發(fā)出去。另外，由于同等重量的培養(yǎng)基中麩皮含量最多，而孢子產(chǎn)量隨麩皮量即麩皮表面積（在一定范圍內(nèi)）的增加而增加。但是淀粉含量9.26%的麩皮培養(yǎng)基，淘洗后丟失的不僅僅是淀粉，同時(shí)也會(huì)損失其他有利于黑曲霉生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)束的孢子數(shù)淀粉含量高的麩曲較少，但是比淀粉含量15.56%的麩曲孢子數(shù)多。