張玲 張清華 范琦琦

摘 ? ? ?要：對鬼針草莖、葉經(jīng)微生物發(fā)酵前后總黃酮HPLC色譜圖進(jìn)行了分析比較。采用Welch materials-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長360 nm，得HPLC色譜圖，再對各色譜圖的各色譜峰的相對率進(jìn)行分析比較。結(jié)果鬼針草莖、葉發(fā)酵前后HPLC指紋圖譜有較明顯的改變，各吸收峰相對率也有較顯著的改變。微生物發(fā)酵使鬼針草總黃酮中某些化學(xué)成分發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，其化學(xué)成分的組成有較顯著的變化。

關(guān) ?鍵 ?詞：鬼針草;總黃酮;微生物發(fā)酵;HPLC

中圖分類號：TQ 041 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）02-0317-04

Abstract： To carry out the comparative study on HPLC chromatogram of total flavonoids in the stems and leaves of Bidens bipinnata L. before and after the microbial fermentation，Welch materials-C18 column was used for gradient elution of acetonitrile-0.2% formic acid in aqueous solution， the detection wavelength was 360 nm and the HPLC chromatogram was obtained. Then， the relative rate of each peak of chromatogram was analyzed and compared. The HPLC fingerprints of stems and leaves of Bidens bipinnata L. had obvious changes before and after fermentation， and the relative rates of absorption peaks also had significant changes. Microbial fermentation resulted in the biotransformation of some chemical constituents in the total flavonoids of Bidens bipinnata L.， and the composition of the chemical constituents had significant change.

Key words： Bidens bipinnata L.; Total flavonoids; Microbial fermentation; HPLC

發(fā)酵中藥為我國傳統(tǒng)中藥加工炮制的重要方法之一，具有悠久的歷史，目前臨床應(yīng)用的發(fā)酵中藥品種主要有神曲、半夏曲、紅曲、淡豆豉等。利用微生物來發(fā)酵中藥本質(zhì)上為利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的各種酶類來催化中藥中的有效成分的一種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。利用微生物強(qiáng)大的生物轉(zhuǎn)化能力可以大幅度提高中藥活性成分的含量，或者可以生成新的活性成分，提高中藥的藥效，降低毒副作用，擴(kuò)大藥用資源等[1-9]。但是傳統(tǒng)的中藥發(fā)酵是一種粗放式的自然發(fā)酵，發(fā)酵過程不易控制，僅僅利用的是自然界的菌種，且菌種通常不純，為幾種甚至幾十種，并且在發(fā)酵的過程中極有可能混入有害菌種，這些因素都極大地限制了微生物的作用，使微生物在中藥中的應(yīng)用前景沒有最大限度地發(fā)揮出來?，F(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)，又稱為中藥微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，融入了現(xiàn)代生物技術(shù)和手段設(shè)備的方法，能夠準(zhǔn)確控制發(fā)酵的菌種種類與數(shù)量，同時對發(fā)酵過程中涉及到的影響發(fā)酵的溫度、濕度、pH值、時間等因素都可以實現(xiàn)有效準(zhǔn)確的動態(tài)控制，所得發(fā)酵品的質(zhì)量可控水平大幅度提升。因此利用微生物發(fā)酵中藥來研究開發(fā)特色新藥具有廣闊的應(yīng)用前景和挑戰(zhàn)。中藥鬼針草為鬼針草屬植物（Bidens）的干燥全草，目前，國內(nèi)外對鬼針草的研究主要體現(xiàn)在鬼針草的資源考證及分布、鬼針草中主要化學(xué)成分的分離制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和鬼針草的藥理作用等方面[10-13]，目前對其微生物發(fā)酵的報道較少。本課題組前期的研究結(jié)果表明發(fā)酵鬼針草中的部分成分的含量發(fā)生了變化[14，15]，推測其成分組成也有可能不同。本文主要對發(fā)酵前后莖、葉純化后的總黃酮，采用HPLC法研究其總黃酮色譜圖的區(qū)別，為微生物發(fā)酵鬼針草的藥效學(xué)研究提供依據(jù)。

1 ?儀器、材料

DT-100型分析天平（北京醫(yī)用儀器廠），Agilent 1100型高效液相色譜儀配有DAD檢測器（美國安捷倫公司）;石油醚、甲醇均為分析純，購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司;乙腈（色譜純）、甲酸（分析純）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;藥材鬼針草自采于濟(jì)南市郊區(qū)，經(jīng)鑒定為菊科鬼針草屬植物鬼針草BidenspilosaLinn.的干燥全草。

2 ?方法、結(jié)果

2.1 ?鬼針草莖和葉微生物發(fā)酵前后樣品的處理

2.1.1 ?鬼針草莖和葉的微生物發(fā)酵液的制備

稱取鬼針草莖、葉粗粉各適量，加15倍量水浸泡30 min后于115 ℃滅菌50 min，冷卻以后接入預(yù)培養(yǎng)的短雙歧桿菌菌液，接種量為1%，于37 ℃培養(yǎng)6 h后接入嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌，接種量均為0.5%，繼續(xù)培養(yǎng)共72 h后結(jié)束。將發(fā)酵液加熱至沸滅菌，中藥渣擠干，擠出液離心，轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1，離心后的發(fā)酵液分裝于250 mL玻璃瓶，115?℃滅菌30 min，得發(fā)酵成品，莖和葉的發(fā)酵液濃度均為10%。

2.1.2 ?鬼針草莖和葉水提液的制備

稱取鬼針草莖和葉粗粉各10 g，加15倍量水浸泡30 min后加熱煮沸提取60 min，過濾，藥渣再用10倍量水煮沸提取一次，過濾，合并兩次濾液濃縮后用水定容至100 mL得莖和葉的水提液，濃度均為10%。

2.1.3 ?鬼針草莖、葉發(fā)酵液和水提液中總黃酮純化

精確量取鬼針草莖、葉發(fā)酵液、鬼針草莖、葉水提液各100 mL（各相當(dāng)于原藥材10 g），各用石油醚萃取兩次，水層上樣于預(yù)處理過的HPD100型大孔樹脂，樹脂用量均為300 mL，樹脂柱徑高比均為1∶12，上樣流速2 VB·h-1。用水洗脫2倍柱體積后再用60%乙醇洗脫8倍柱體積，將60%乙醇洗脫液合并回收溶劑，干燥得純化總黃酮。

2.2 ?供試品溶液的制備

精密稱取2.1.3項下的總黃酮各100 mg， 用甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，取續(xù)濾液作為鬼針草莖、葉微生物發(fā)酵前后供試品溶液。

2.3 ?HPLC色譜條件

采用Welch materials C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃，以乙腈（A）- 0.2%甲酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫，流速1 mL·min-1，A∶B的比例見表1。檢測波長360 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.4 ?HPLC色譜條件方法學(xué)考察[16，17]

2.4.1 ?精密度試驗

取同一個供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC圖，計算各色譜峰的相對保留時間和各色譜峰的相對峰面積的RSD均小于0.83 %、1.72 %（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.4.2 ?穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣進(jìn)行檢測。各色譜峰的相對保留時間和各色譜峰的相對峰面積的RSD均小于0.92%、1.89%（n=6），表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 ?重復(fù)性試驗

精密稱取6份樣品，按供試品溶液制備方法制備供試液，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，各色譜峰的相對保留時間和各色譜峰的相對峰面積的RSD均小于0.76%、2.85%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.5 ?供試品溶液的HPLC指紋圖譜的測定

將2.2項下制備的4種供試品溶液，按2.3項下的色譜條件分別進(jìn)行檢測，記錄HPLC圖，結(jié)果見圖1。

2.6 ?結(jié)果

鬼針草莖、葉發(fā)酵前后HPLC指紋圖譜有較明顯的改變。鬼針草葉水提液中色譜峰最多，以它為對照標(biāo)示出23個吸收峰，其中10號峰為異槲皮苷的吸收峰。鬼針草發(fā)酵葉中沒有12號、14號、20號、23號明顯的吸收峰;鬼針草水提莖、發(fā)酵莖中無14號、17號、18號、21號明顯的吸收峰，但有較明顯的23號峰的吸收。其他吸收峰之間的相對比例也有較顯著的改變。

對各自樣品以自身10號峰即異槲皮苷的峰面積為分母，其他各峰峰面積分別為分子，計算出各峰的相對率，結(jié)果見表2。以各色譜峰相對率作柱狀圖，見圖2、3。

由圖2、圖3柱狀圖可見，鬼針草葉發(fā)酵后色譜峰相對率明顯升高的峰有1、2、3、4、5、7、15、16、19、21號峰;鬼針草莖發(fā)酵后色譜峰相對率明顯升高的峰有1、2、3、5、8、、9、20、23號峰。

由結(jié)果可知，鬼針草發(fā)酵前后化學(xué)成分的組成有較顯著的變化。

3 ?討論

實驗考察了樣品在多種檢測波長下的色譜圖并進(jìn)行比較，結(jié)果顯示各樣品在360 nm波長下均具有較大的吸收，吸收峰較多，基線較平穩(wěn)，因此本實驗最終確定的檢測波長為360 nm。

鬼針草莖、和葉的組織構(gòu)造不同，以上研究表明，鬼針草莖中的化學(xué)成分組成和含量均要少于鬼針草葉。通過比較分析鬼針草莖和葉經(jīng)微生物發(fā)酵前后純化后的總黃酮HPLC色譜圖的變化可知，鬼針草經(jīng)微生物發(fā)酵以后化學(xué)成分的組成和某些成分的相對含量均有較顯著的變化。鬼針草葉純化后總黃酮的12號峰和14號峰發(fā)酵后沒有檢測到明顯的吸收峰，可能是該成分在微生物發(fā)酵的過程中進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化從而轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，至于12號峰和14號峰所對應(yīng)的化合物的具體結(jié)構(gòu)還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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