李寐華，楊 永，馬新力，張學(xué)軍，張 紅，張永兵，伊鴻平

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】雜種優(yōu)勢(shì)已廣泛應(yīng)用于作物育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1]。西瓜具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)為植株長(zhǎng)勢(shì)旺，果實(shí)品質(zhì)好，產(chǎn)量高，抗病，抗逆性強(qiáng)等[2]，目前中國(guó)西瓜生產(chǎn)用種100%為雜交種[3]。雜交種子在生產(chǎn)過(guò)程中由于人工去雄不徹底、套帽夾花不嚴(yán)或機(jī)械混雜等，易導(dǎo)致?lián)饺肽副痉N子或外來(lái)雜種子[4,5]。雜交種子的純度和真實(shí)性是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，是決定西瓜生產(chǎn)產(chǎn)量和品質(zhì)的重要保障，關(guān)系到種子銷售企業(yè)的品牌效益，雜交種子在銷售前進(jìn)行純度和真實(shí)性鑒定,對(duì)滿足制種單位種子快速準(zhǔn)確鑒定有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphism DNA，RAPD)技術(shù)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR) 技術(shù)等均已應(yīng)用于西瓜雜交種純度鑒定[3,6～7]，其中SSR標(biāo)記因其分布均勻、共顯性遺傳、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好等在雜交種純度鑒定方面的應(yīng)用最為廣泛?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】早佳8424西瓜是20世紀(jì)80年代培育的早熟、品質(zhì)極佳且具有廣泛生態(tài)適應(yīng)性的露地、設(shè)施兼可種植的雜交種。2018年全國(guó)種植面積約26.67×104hm2(400萬(wàn)畝)。隨著早佳8424西瓜品種種植面積不斷擴(kuò)大，種子需求量和制種面積不斷增加，種子真實(shí)性和純度的高通量快速準(zhǔn)確鑒定成為制種單位的迫切需求。早佳8424西瓜種子純度的傳統(tǒng)鑒定主要依據(jù)田間形態(tài)學(xué)鑒定，即F1雜交種果皮為綠底墨綠色條帶，而母本果皮為淺綠底核桃紋條帶。傳統(tǒng)鑒定需要品種特異農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出來(lái)才能進(jìn)行鑒別，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且受季節(jié)限制，易受環(huán)境因素影響。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用早佳8424西瓜及其雙親篩選獲得4對(duì)SSR共顯性分子標(biāo)記，在對(duì)單一標(biāo)記優(yōu)化的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建雙重PCR擴(kuò)增體系，將條帶大小具有明顯差異的分子標(biāo)記組合應(yīng)用于雜交種純度鑒定，采用堿裂解法提取DNA法鑒定早佳8424西瓜雜交種子純度和真實(shí)性。

1 材料與方法

1.1 材 料

西瓜品種早佳8424(F1)及其父母雙親T2(P2)、伊選(P1)共3份材料均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

改良CTAB法：取早佳8424西瓜及其父母雙親各10粒種子置于35℃培養(yǎng)箱中催芽約36 h至露出胚根即可，將10粒種子胚根等量混為1個(gè)樣品，置于2 mL離心管中，然后加入1個(gè)約5 mm的鋼珠和500 μL CTAB。利用羅氏MagNA Lyser組織勻漿儀以2 500 r/min震蕩30 s，每管加入500 μL氯仿異戊醇，上下顛倒震蕩50次，12 000 r/min離心3 min，吸取200 μL上清液于新的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇上下顛倒50次混勻，12 000 r/min離心3 min，用70%無(wú)水乙醇清洗2次，于80℃烘箱中約10 min蒸干，然后用200 μL ddH2O溶解。取2 μL DNA溶液，利用Q3000超微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA濃度和純度，取適量樣品DNA母液統(tǒng)一稀釋為20 ng/μL存放于-20℃冰箱中備用，DNA母液存放于-80℃冰箱中長(zhǎng)期保存。提取大量樣品時(shí)，為進(jìn)一步提高效率，異丙醇沉降及70%無(wú)水乙醇清洗步驟可利用96孔PCR板結(jié)合排槍完成，離心時(shí)改用平板離心機(jī)4 680 r/min離心10 min，其它步驟同上。

堿裂解法：配置BufferA溶液(100 mM NaOH+2%Tween)和BufferB溶液(100 mM Tris-HCl+2 mM EDTA)。將待檢測(cè)樣品嫩葉或胚根置于96孔PCR板中，加入50 μL BufferA溶液，置于PCR儀中95℃溫浴10 min中，加入50 μL BufferB溶液，上下顛倒50次混勻，取2 μL用于PCR擴(kuò)增。

利用早佳8424母本伊選和父本T2從72對(duì)SSR引物中共篩選出4對(duì)呈現(xiàn)明顯差異的分子標(biāo)記。

1.2.2 SSR多態(tài)性引物的篩選

72對(duì)SSR引物由上海生物工程有限公司合成，具體引物信息詳見T. Joobeur等[9]、范建光等[10]和李麗等[4]。以早佳8424及其雙親基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出在早佳8424雙親間呈現(xiàn)多態(tài)性且早佳8424帶型為雙親復(fù)合型的SSR引物。PCR反應(yīng)體系10 μL，其中2×EasyTaqPCR SuperMix for PAGE(北京全式金生物技術(shù)有限公司) 5 μL，濃度為10 μM的正向引物和反向引物各0.25 μL，ddH2O 3.5 μL，DNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性 3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min；PCR產(chǎn)物4℃ 保存。利用6%的聚丙烯酰胺凝膠170 V電泳1 h，通過(guò)銀染法染色觀察。表1

為保障多重PCR技術(shù)體系的建立，以早佳8424雜交種DNA為模板，對(duì)4個(gè)標(biāo)記的最佳退火溫度進(jìn)行篩選。

1.2.3 西瓜雜交種早佳8424純度的田間鑒定和SSR分子標(biāo)記鑒定

西瓜雜交種早佳8424純度的田間鑒定在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心亞爾鄉(xiāng)基地進(jìn)行。利用直徑約5 mm的打孔器按照田間種植順序依次取192株植株嫩葉置于96孔PCR板中，采用堿裂解法提取DNA，利用篩選出的SSR分子標(biāo)記鑒定，并將鑒定結(jié)果同田間鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。

雜交種純度=(1-雜種子數(shù)量/檢測(cè)種子總數(shù))×100%。

采集田間種植的早佳8424植株嫩葉，采用堿裂解法快速提取其DNA。利用WS27+MCPI-05組合對(duì)早佳8424雜交種純度進(jìn)行分子鑒定。

早佳8424西瓜果實(shí)呈圓球形，綠底果面并覆有墨綠條帶，而其母本為淺綠底核桃紋條帶，將早佳8424果面特征作為田間鑒定的最主要依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 早佳8424雜交種純度SSR鑒定標(biāo)記篩選

研究表明,4對(duì)引物在早佳8424上的帶型均呈現(xiàn)為雙親復(fù)合型,4對(duì)引物均可應(yīng)用于早佳8424西瓜的雜交種純度鑒定。引物BVWS00106和BVWS00333分別位于第5號(hào)和第9號(hào)染色體上，引物WS27和MCPI-05均位于第6號(hào)染色體上，4對(duì)引物PCR擴(kuò)增片段大小均在100～300 bp。圖1

表1 早佳8424雜交種純度鑒定引物

Table 1 Primers used for genetic purity testing in hybrid Zaojia 8424 watermelon

引物名稱Primer正向引物序列Forward primer反向引物序列Reverse primer染色體位置ChromosomeBVWS00106TGGCCTAGAAGATTATTGAGCTGCCATTATCACATGGCAGATAATGGAAAChr5BVWS00333TGTTGAGATTCTTTGATTTCAACTGTTGGGTCAAAGTATTTTTGCTTTTTChr9WS27TTCTCTTCATTCCCCCAAAATCACGGGTGAGGGAAAACGAGChr6MCPI-05ATTTCTGGCCCCAGTGTAAGGAACAACGCAACCACGTATGChr6

圖1 4對(duì)SSR引物的PCR擴(kuò)增圖譜

Fig.1 SSR profile of Zaojia8424 and its parents amplified with the four primers

2.2 雙重PCR擴(kuò)增

研究表明,篩選出的4個(gè)標(biāo)記根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小可進(jìn)行不同組合。60.2℃為最佳退火溫度，退火溫度小于60.2℃時(shí)4個(gè)標(biāo)記均有不同程度的非特異性擴(kuò)增，當(dāng)退火溫度高于60.2℃，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量隨溫度升高逐漸降低甚至無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。配制BVWS00106+BVWS00333、BVWS00106+WS27、BVWS00333+WS27、BVWS00333+MCPI-05、WS27+MCPI-05、BVWS00106+BVWS00333+WS27和BVWS00333+WS27+MCPI-05等7個(gè)組合在60℃退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。BVWS00106+BVWS00333、BVWS00333+WS27、BVWS00333+MCPI-05和WS27+MCPI-05等4種組合能夠用于早佳8424雜交種純度鑒定，其它3種組合形式擴(kuò)增失敗。將不同引物組合進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增或選擇偏好性擴(kuò)增甚至相互抑制的現(xiàn)象，如BVWS00106+BVWS00333組合，兩對(duì)引物PCR產(chǎn)物濃度均明顯低于單一擴(kuò)增；BVWS00333+WS27組合和BVWS00333+MCPI-05組合擴(kuò)增時(shí)，BVWS00333引物PCR擴(kuò)增均受到了抑制；將3對(duì)引物混合擴(kuò)增時(shí)，均未能獲得理想的PCR產(chǎn)物。圖2,圖3

注：1、2、3和4分別代表引物 VWS00106、BVWS00333、WS27和MCPI-05

Note:1, 2, 3 and 4 represent primer BVWS00106, BVWS00333, WS27 and McPi-05 ,respectively

圖2 4對(duì)引物最佳退火溫度的篩選

Fig. 2 Selection of optimum annealing temperature for the four SSR primers

圖3 不同引物組合的多重PCR擴(kuò)增

Fig. 3 Multiple PCR amplification for different primer combinations

2.3 早佳8424雜交種純度SSR分子標(biāo)記鑒定

研究表明,第49號(hào)植株帶型與早佳8424母本帶型一致，缺少其父本帶型，因此,認(rèn)定為雜種子，其它植株帶型均為早佳8424雙親的復(fù)合帶型，為真實(shí)的雜交種，該批樣品雜交種純度為99.5%。圖4

圖4 利用WS27+MCPI-05組合對(duì)早佳8424雜交種純度的鑒定

Fig. 4 WS27+ McPi-05 combination was used to identify the hybrid purity of zaojia 8424

2.4 早佳8424雜交種純度的田間鑒定

在田間共種植200株，經(jīng)田間實(shí)地考察，第49株果實(shí)呈現(xiàn)為母本的果面特征，其余植株均為真實(shí)雜交種的果面特征，與分子鑒定結(jié)果完全一致，該批樣品雜交種純度為99.5%，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)早佳8424西瓜雜交種純度進(jìn)行鑒定是切實(shí)可行的。

3 討 論

3.1 西瓜雜交種的生產(chǎn)及其純度鑒定

西瓜一般為雌雄異花同株，偶爾也出現(xiàn)完全花和雄花同株。在西瓜雜交種生產(chǎn)過(guò)程中，要嚴(yán)格遵照雜交種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程，對(duì)易引起混雜的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行嚴(yán)格把控，及時(shí)拔除制種田中的雜株、避免套冒夾花不嚴(yán)造成自交或串入其它花粉，避免在種子收獲、精選過(guò)程中的機(jī)械混雜等，以保障雜交種子的純度。目前用于西瓜雜交種純度鑒定的方法主要分為兩大類，利用形態(tài)學(xué)觀察的傳統(tǒng)田間鑒定和利用分子標(biāo)記圖譜信息的室內(nèi)鑒定。早佳8424西瓜傳統(tǒng)田間鑒定主要利用幼果期果皮附著條帶來(lái)判斷，果皮表面呈現(xiàn)為淺綠底核桃紋條帶的即為雜種子。采用傳統(tǒng)鑒定方法需要幼果膨大到一定階段待果面特征顯現(xiàn)出來(lái)才能準(zhǔn)確鑒定，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，當(dāng)年收獲的種子僅能在吐魯番或南方通過(guò)設(shè)施大棚種植鑒定，甚至次年才能獲得鑒定結(jié)果，鑒定周期長(zhǎng)，成本高昂[11]，但由于形態(tài)學(xué)性狀直觀可見，該方法目前依然在廣泛使用。利用分子標(biāo)記對(duì)雜交種純度鑒定，不受外界環(huán)境限制，簡(jiǎn)單快速，便于規(guī)?；?、自動(dòng)化流水作業(yè)[3,12～13]。尤其是SSR標(biāo)記，因其對(duì)DNA質(zhì)量要求低，共顯性遺傳，譜帶信息清晰，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前開發(fā)應(yīng)用最多，被認(rèn)為比較理想的用于西瓜雜交種純度鑒定的分子標(biāo)記[12]。相比于形態(tài)學(xué)性狀觀察，SSR位點(diǎn)的差異不受人為選擇傾向的影響，對(duì)品種的檢測(cè)是一個(gè)綜合客觀的評(píng)價(jià)[4]，鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確有效。

3.2 SSR分子標(biāo)記鑒定體系及優(yōu)化

SSR分子標(biāo)記鑒定主要包括DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)3個(gè)步驟。DNA快速高通量提取是關(guān)鍵限速環(huán)節(jié)。DNA提取主要包括試劑盒膜吸附洗脫提取、CTAB提取和堿裂解法提取3種方法。在大規(guī)模雜交種純度鑒定時(shí)，試劑盒膜吸附洗脫提取法因成本高昂且不能有效結(jié)合排槍批量操作不宜采納。堿裂解法避免了離心及更換離心管等操作，簡(jiǎn)便易行，大大提高了DNA提取效率，一般濃度相對(duì)較低，質(zhì)量較差，但可以滿足SSR-PCR擴(kuò)增，可用于雜交種純度SSR分子標(biāo)記鑒定[10]。

單一分子標(biāo)記PCR可有效區(qū)分混入雜交種中的母本種子，但雙重或多重分子標(biāo)記PCR可獲得更為準(zhǔn)確可靠的鑒定結(jié)果。劉子記等[3]建立了小型西瓜美月雜交種純度雙重PCR鑒定體系，與單一PCR相比，進(jìn)一步降低了檢測(cè)時(shí)間和費(fèi)用。研究共篩選出4對(duì)可用于早佳8424西瓜雜交種純度鑒定的引物，并獲得4種組合進(jìn)行雙重PCR，當(dāng)某一引物出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，可有效替補(bǔ)。在PCR過(guò)程中需要針對(duì)不同的引物篩選其最佳退火溫度，避免非特異性擴(kuò)增對(duì)鑒定結(jié)果造成干擾，不同DNA聚合酶及PCR擴(kuò)增體系都會(huì)影響PCR擴(kuò)增的特異性[13]，當(dāng)更換不同品牌的PCR mix時(shí)，要對(duì)PCR擴(kuò)增體系及PCR擴(kuò)增程序重新進(jìn)行探索修正，并在鑒定過(guò)程盡可能避免更換試劑。

4 結(jié) 論

以早佳8424及其雙親為試驗(yàn)材料，從72對(duì)SSR引物中篩選獲得4對(duì)在早佳8424上表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)帶型的引物，分布于3條染色體上，片段大小約100～300 bp。將擴(kuò)增片段大小不同的引物進(jìn)行雙重或多重PCR擴(kuò)增，獲得4個(gè)雙重PCR組合。將SSR分子標(biāo)記鑒定同田間傳統(tǒng)鑒定進(jìn)行比較，結(jié)果完全一致，SSR標(biāo)記及其組合切實(shí)可用于西瓜雜交種早佳8424純度鑒定，效率高，操作簡(jiǎn)便，適于室內(nèi)高通量流水作業(yè)。