何 苗，趙霄晨，朱金輝，吳 靜，白 海

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院血液科，甘肅蘭州 730050)

急性髓系白血病(AML)是一組異質(zhì)性造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，其中白血病細(xì)胞核型及分子生物學(xué)異常是最主要的分層治療和預(yù)后指標(biāo)。多數(shù)患者伴有非隨機(jī)的染色體異常。AML部分成熟型的M2b亞型是中國(guó)學(xué)者于20世紀(jì)50年代末提出的，具有髓外浸潤(rùn)率高、治療反應(yīng)好、完全緩解率高、緩解期長(zhǎng)等特點(diǎn)。其主要發(fā)病原因是由于t(8；21)(q22；q22)累及8號(hào)染色體上的ETO基因和21號(hào)染色體上的AML1基因易位導(dǎo)致AML1-ETO病變發(fā)生[1-2]。伴inv(16)(p13;q22)或t(16；16)(p13；q22)的AML常見(jiàn)于90%以上的急性白血病M4EO型患者，為16號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的CBFβ基因與短臂上的平滑肌肌球蛋白重鏈基因(MYH11)產(chǎn)生融合，形成CBFβ-MYH11和MYH11-CBFβ兩種融合基因，其中CBFβ-MYH11融合基因易促使白血病發(fā)病。伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性AML患者在鞏固期應(yīng)用大劑量阿糖胞苷，可獲得較長(zhǎng)時(shí)間的完全緩解，但老年患者生存期縮短，KIT突變的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高[3-4]。本研究分析了16例伴AML1-ETO陽(yáng)性和7例伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性AML患者的骨髓細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，旨在探討形態(tài)對(duì)判斷這些基因陽(yáng)性的參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院于2016年1月至2018年12月初診伴AML1-ETO陽(yáng)性的AML患者16例納入研究，男11例、女5例，中位年齡35歲(9～60歲)，其中FAB分型AML-M2b型14例，AML-M5型2例。血常規(guī)檢查：白細(xì)胞(1.3～56.0)×109/L，血紅蛋白35～112 g/L，血小板(2～122)×109/L。伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性AML患者7例，男4例、女3例，中位年齡49歲(26～62歲)，其中FAB分型AML-M4EO型6例，AML-M5型1例，血常規(guī)檢查：白細(xì)胞(2.3～158.0)×109/L，血紅蛋白(48～102 g/L)；血小板(4～78)×109/L。

1.2儀器與試劑 血常規(guī)檢測(cè)儀器(Mindray BC-5800)、普通光學(xué)顯微鏡(Leica DM2000)、流式細(xì)胞儀(BD FACSCantoll)、PCR儀(Applied Biosystems)；瑞士吉姆薩染色、過(guò)氧化物酶染液購(gòu)自索萊寶公司；血常規(guī)檢測(cè)試劑購(gòu)自Mindray公司、流式試劑購(gòu)自BD公司、PCR試劑購(gòu)自上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3方法 瑞士吉姆薩染色、油鏡觀察外周血及骨髓細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞化學(xué)過(guò)氧化物酶染色觀察白血病細(xì)胞酶型；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白血病細(xì)胞免疫表型；PCR法檢測(cè)白血病43種融合基因；G顯帶法觀察染色體核型；一代測(cè)序毛細(xì)管電泳法方法檢測(cè)髓系預(yù)后基因[FLT3-ITD3、FLT3-TKD、C-kit(Exon8、Exon17)、DNMT3a、NPM1、CEBPα(4項(xiàng))]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將伴AML1-ETO陽(yáng)性和伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者外周血及骨髓原始細(xì)胞、異常中幼粒細(xì)胞及異常嗜酸等細(xì)胞比例，染色體核型及預(yù)后基因用三線表進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1外周血細(xì)胞形態(tài) 伴AML1-ETO陽(yáng)性患者中，8例外周血中均以原始粒細(xì)胞增生為主(23%～95%)，6例患者原始粒細(xì)胞(21%～64%)和異常中幼粒細(xì)胞同時(shí)增多(5%～32%)，其余2例以原始和幼稚單核細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“原幼單核細(xì)胞”)增生為主(78%～92%)，見(jiàn)表1。伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者中，4例外周血中均以原幼單核細(xì)胞增生為主(21%～88%)，2例原幼單核細(xì)胞(23%～44%)和原始粒細(xì)胞(15%～30%)同時(shí)增多并伴隨異常嗜酸性粒細(xì)胞增多(8%～12%)，1例未見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增多，見(jiàn)表2。

表1 伴AML1-ETO陽(yáng)性患者外周血及骨髓細(xì)胞比例

注：*表示以原幼單核細(xì)胞增生為主，5號(hào)的外周血、骨髓原幼單核細(xì)胞比例分別為78%、84%，11號(hào)的外周血、骨髓原幼單核細(xì)胞比例分別92%、94%；-表示未見(jiàn)到原始粒細(xì)胞和異常中幼粒細(xì)胞增多。

表2 伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者外周血及骨髓細(xì)胞比例

注：-表示該項(xiàng)為陰性。

2.2骨髓細(xì)胞形態(tài) 伴AML1-ETO陽(yáng)性患者中，6例骨髓增生極度活躍，4例患者增生明顯活躍，4例增生活躍，2例增生減低。14例原始粒細(xì)胞比例為28%～85%，原始粒細(xì)胞可見(jiàn)明顯的核凹陷，凹陷處淡染，見(jiàn)圖1a，淡染處可見(jiàn)Auer小體，細(xì)胞化學(xué)過(guò)氧化物酶染色(MPO)染色凹陷區(qū)域呈團(tuán)塊狀反應(yīng)；異常中幼粒細(xì)胞比例為15%～32%，核漿發(fā)育不平衡，呈現(xiàn)“核幼漿老”、胞質(zhì)染色異常、“朝陽(yáng)紅”或“黃沙樣”改變、局部的朝陽(yáng)紅彌漫黃沙土樣，見(jiàn)圖1b；細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)空泡、Auer小體、包涵體(假性Chediak-Higash顆粒)，核分葉不良(如假Pelger-Huet核)可見(jiàn)。另外2例患者以原幼單核細(xì)胞增生為主(84%～94%)，未見(jiàn)到原始粒細(xì)胞和異常中幼粒細(xì)胞增多，見(jiàn)表1。

伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者中，2例極度活躍，4例明顯活躍，1例增生活躍。5例原幼單核細(xì)胞比例為24%～87%，胞體大，胞漿豐富、灰藍(lán)色，核扭曲、折疊、不規(guī)則，染色質(zhì)細(xì)致、豐富、分布均勻，核仁1～2個(gè)，見(jiàn)圖1c，MPO染色弱陽(yáng)性；2例原幼單核細(xì)胞細(xì)胞(32%～72%)和原始粒細(xì)胞同時(shí)增多(10%～25%)，原始粒細(xì)胞胞體小、胞漿量少、藍(lán)色、核圓形、染色質(zhì)細(xì)致。嗜酸性粒細(xì)胞0.50%～32%，只有1例為0.5%，其余6例患者>5%，為FAB分型中的AML-M4EO，各階段的異常嗜酸性粒細(xì)胞增多，主要為中、晚幼嗜酸性粒細(xì)胞，其胞質(zhì)中充滿粗大、大小不一、深染的棕黑色異常嗜堿性顆粒和橘黃色嗜酸性顆粒，有的顆粒非常密集覆蓋于核上，看不清細(xì)胞形態(tài)，有些成熟嗜酸性粒細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核分葉不良，見(jiàn)圖1d、表2。

2.3免疫表型 伴AML1-ETO陽(yáng)性患者均表達(dá)髓系原始細(xì)胞標(biāo)記：CD34、CD38、HLA-DR、CD33、CD117、CD123、MPO，90%患者表達(dá)CD56，80%患者表達(dá)CD19，5%的患者跨系表達(dá)淋系抗原CD7和CD9，部分患者表達(dá)除表達(dá)髓系原始細(xì)胞標(biāo)記外，還表達(dá)髓系成熟細(xì)胞標(biāo)記CD15、CD11b、CD16、CD14、CD64。伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者原始細(xì)胞中CD117、HLA-DR、CD38、CD13均全部表達(dá)，CD34、CD9、CD33和CD64表達(dá)的比例逐漸降低；CD15、CD11b和CD14的表達(dá)均較低。嗜酸性粒細(xì)胞也表達(dá)CD13、CD33、CD11b，但CD16陰性，部分有成熟嗜酸性粒細(xì)胞的患者表達(dá)CD9和CD123。

注：a為帶小凹的原始粒細(xì)胞；b為異常中幼粒細(xì)胞；c為原幼單核細(xì)胞；d為異常嗜酸性粒細(xì)胞。

圖1各種細(xì)胞形態(tài)

2.4染色體核型分析及預(yù)后分析 本研究發(fā)現(xiàn)，伴AML1-ETO陽(yáng)性6例(40%)患者只有染色體結(jié)構(gòu)異常，即t(8；21)(q22；q22)；8例(47%)患者染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目均有異常，此類(lèi)患者預(yù)后很差；其余2例(13%)患者核型正常(表3)。伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者4例(57%)只有染色體結(jié)構(gòu)異常，即inv(16)(p13.1q22)或t(16；16)(p13.1；q22)，其余3例(43%)患者染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目均有異常，為復(fù)雜核型，見(jiàn)表4。

髓系預(yù)后基因[FLT3-ITD3、FLT3-TKD、C-kit(Exon8、Exon17)、DNMT3a、NPM1、CEBPα(4項(xiàng))]篩查發(fā)現(xiàn)，伴AML1-ETO陽(yáng)性1例(6%)患者FLT3-ITD3陽(yáng)性，1例(6%)患者C-kit陽(yáng)性，12例(75%)患者WT1陽(yáng)性，4例(25%)均未見(jiàn)到陽(yáng)性，見(jiàn)表3。伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性約5例(70%)患者WT1陽(yáng)性，其他預(yù)后基因均未見(jiàn)到，見(jiàn)表4。

2.5療效分析 伴AML1-ETO陽(yáng)性，無(wú)CD56表達(dá)，染色體核型為正常核型或只有t(8；21)(q22；q22)異常，歸為低危組；若有CD56表達(dá)，染色體為復(fù)雜核型，預(yù)后基因陽(yáng)性，化療2個(gè)療程后AML1-ETO定量檢測(cè)未小于10-3copies/mL中的任何一種情況都被歸到高危組[5]。本研究低危組中的2例患者均使用傳統(tǒng)化療方案[TA(吡柔比星20 mg/d 3 d，阿糖胞苷0.1 μg/m27 d)或DA(柔紅霉素60 mg/d 3 d、阿糖胞苷0.1 mg/m27 d)]，第一個(gè)療程達(dá)到緩解；其余14例高危組患者，進(jìn)行化療后，10例行造血干細(xì)胞移植，其中復(fù)發(fā)4例，死亡2例，生存6例；其余4例高?；颊?例化療后均未緩解，死亡；2例放棄治療。伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者使用傳統(tǒng)化療方案，目前6例均生存，1例行造血干細(xì)胞移植，只有1例死亡。

表3 伴AML1-ETO陽(yáng)性患者染色體核型分析及預(yù)后基因分析

注：-表示該項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

表4 伴CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者染色體核型分析及預(yù)后基因分析

注：-表示該項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

3 討 論

3.1形態(tài)學(xué)對(duì)AML1-ETO陽(yáng)性的提示作用 t(8；21)(q22；q22)是一種特殊的白血病亞型，具有獨(dú)特的生物遺傳學(xué)特征，導(dǎo)致8號(hào)染色體的ETO基因和21號(hào)染色體上的AML1基因發(fā)生重排，形成AML1-ETO融合基因[6]。核結(jié)合因子(CBF)是一個(gè)造血所必需的二聚體，其兩個(gè)成分的基因RUNX1(也稱(chēng)AML1或CBFA)和CBFβ的重排與急性白血病相關(guān)，t(8；21)(q22；q22)累及編碼CBF亞單位α的RUNX1基因和RUNX1N1(ETO)基因。RUNX1-RUNX1N1使CBF發(fā)生轉(zhuǎn)化很可能是由于正常RUNX1靶基因通過(guò)異常招募核轉(zhuǎn)錄共抑制復(fù)合物致使轉(zhuǎn)錄抑制所致[7]。

當(dāng)形態(tài)學(xué)見(jiàn)到以下三種情況時(shí)高度提示該患者AML1-ETO陽(yáng)性。第一，以原始粒細(xì)胞增多為主，原始粒細(xì)胞可見(jiàn)明顯的核凹陷，凹陷處淡染，淡染處可見(jiàn)Auer小體，MPO染色凹陷區(qū)域可呈團(tuán)塊狀反應(yīng)；第二，核漿發(fā)育不平衡的異常中幼粒細(xì)胞增多，胞質(zhì)染色異常、呈“朝陽(yáng)紅”或“黃沙樣”改變，胞質(zhì)中可見(jiàn)空泡、Auer小體、包涵體(假性Chediak-Higash顆粒)，核分葉不良(如假Pelger-Huet核)，此時(shí)要注意與骨髓增生異常綜合征相鑒別；第三，以上兩種形態(tài)的原始粒細(xì)胞和異常中幼粒細(xì)胞同時(shí)增多，此種情況也是最多見(jiàn)的。另外，該病常伴有幼稚嗜酸性粒細(xì)胞比例增高，嗜堿性粒細(xì)胞和/或肥大細(xì)胞有時(shí)增多，單核細(xì)胞很少或缺失；幼紅細(xì)胞及巨核細(xì)胞形態(tài)正常[8-11]。

但是AML1-ETO和此形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的吻合率并不是100%，因?yàn)锳ML-M2b主要由形態(tài)學(xué)界定，其原始粒細(xì)胞以異型中幼粒細(xì)胞增生為主，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道少數(shù)AML-M1、M4、M5等也可表達(dá)AML1-ETO[8]，本研究發(fā)現(xiàn)2例AML-M5中表達(dá)AML1-ETO。因此，形態(tài)學(xué)的AML-M2b并不等于伴AML1-ETO陽(yáng)性的AML。

3.2形態(tài)學(xué)對(duì)CBFβ-MYH11陽(yáng)性的提示作用 FAB分型中定義的AML-M4EO患者中度到重度貧血，血小板重度減少。白細(xì)胞可增多、正?；驕p少，分類(lèi)可見(jiàn)粒系及單核系早期細(xì)胞增生，有時(shí)外周血出現(xiàn)異常嗜酸性粒細(xì)胞，可見(jiàn)異常嗜酸粒細(xì)胞脫顆粒后形成的胞質(zhì)空泡。骨髓除了具有通常AML的形態(tài)學(xué)特征外，各階段的異常嗜酸性粒細(xì)胞增多，主要為中、晚幼嗜酸性粒細(xì)胞，常>5%；除有典型的嗜酸顆粒外，還有大的嗜堿(不成熟)顆粒，不分葉的核的異常嗜酸性粒細(xì)胞，有的顆粒非常密集覆蓋于核上，看不清細(xì)胞形態(tài)，既所謂的異常嗜酸[12]。細(xì)胞化學(xué)染色氯醋酸酯酶及PAS染色明顯陽(yáng)性。這時(shí)要注意與正常階段的幼稚嗜酸性粒細(xì)胞相區(qū)別，幼稚嗜酸性粒細(xì)胞顆粒顏色為深咖啡色，顆粒多，通常溢出漿外，分界不清。當(dāng)形態(tài)看到以上現(xiàn)象，高度提示CBFβ-MYH11陽(yáng)性，但是如果嗜酸粒細(xì)胞比例<5或即使嗜酸性粒細(xì)胞>5%，但未見(jiàn)到異常嗜酸，并不能排除CBFβ-MYH11陽(yáng)性可能。本研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞僅占0.5%，而CBFβ-MYH11陽(yáng)性。相反，有異常嗜酸性粒細(xì)胞的AML并不一定CBFβ-MYH11陽(yáng)性，因此CBFβ-MYH11陽(yáng)性和異常嗜酸性粒細(xì)胞的存在不是正相關(guān)。從形態(tài)的角度出發(fā)判斷融合基因的類(lèi)型會(huì)有遺漏，必須形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)(MICM)多種檢查手段結(jié)合，診斷才能準(zhǔn)確無(wú)誤[13-15]。

4 結(jié) 論

FAB和WHO是兩個(gè)獨(dú)立的白血病分型系統(tǒng)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和MICM的精確診斷，分子生物學(xué)為臨床治療及預(yù)后提供可靠信息，成為白血病診斷中不可缺少的手段之一，單純靠FAB遠(yuǎn)不能滿足臨床對(duì)患者的靶向治療及預(yù)后評(píng)估，本研究提示在伴AML1-ETO和CBFβ-MYH11陽(yáng)性的患者中，通過(guò)FAB分型中的AML-M2b和AML-M4EO對(duì)這兩種基因的發(fā)現(xiàn)率分別為87.5%和86%，符合率較高，但是其余患者若不做分子生物學(xué)檢查，就很難通過(guò)形態(tài)發(fā)現(xiàn)該兩種融合基因陽(yáng)性。因此必須通過(guò)MICM綜合檢查才能對(duì)患者作出準(zhǔn)確的診斷。