黃 瑜，馬嘉霖，周棉鑫，陳敏琪，蔡 佳，簡紀常，湯菊芬

羅非魚干擾素誘導蛋白35基因克隆及表達分析

黃 瑜1,2,3，馬嘉霖1，周棉鑫1，陳敏琪1，蔡 佳1,2,3，簡紀常1,2,3，湯菊芬1,2,3

（1. 廣東海洋大學水產(chǎn)學院 // 2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 // 3. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】研究尼羅羅非魚（）干擾素誘導蛋白35（interferon induced protein 35，ifi35）在免疫反應中的作用?？寺～@得羅非魚基因開放閱讀框序列（GenBank登錄號：XM_003442606；），采用實時熒光定量PCR技術檢測在健康羅非魚不同組織中的分布，以及不同刺激物刺激后的表達。基因編碼區(qū)為1 125 bp，編碼374個氨基酸，理論分子質(zhì)量為42.79 ku，等電點為5.01。含有1個LZD結構域和2個Nmi/IFP 35 domain (NID)。多序列比對發(fā)現(xiàn)On-ifi35與其它物種的ifi35氨基酸序列同源性介于35.23% ~ 93.32%之間，且與斑馬擬麗魚同源性最高。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，與斑馬擬麗魚的ifi35聚為一支。實時熒光定量PCR分析顯示，在健康羅非魚各組織中均有表達，其中在脾臟組織中表達量最高，其次是胸腺、肝臟、心臟、肌肉、腸道、體腎、腦、鰓、頭腎，在皮膚中表達量最低。經(jīng)無乳鏈球菌和PolyI:C刺激后，表達量在脾臟、腸道、體腎和頭腎中均發(fā)生顯著性變化且呈現(xiàn)出顯著的時序性。

尼羅羅非魚；；基因；克??；表達

干擾素（Interferon, IFN）是一類重要的α螺旋細胞因子，在脊椎動物先天性免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要的功能[1-2]。根據(jù)IFN的基因序列與基因結構，結合的受體和功能等方面，干擾素被分為I型（IFN-α和IFN-β）、I1型（IFN-γ）和III型（IFN-λs）。四足動物中擁有3種類型的干擾素，而硬骨魚類僅具有I型和I1型IFN，缺少III型 IFN[3-5]。

干擾素主要通過改變特定基因的表達來影響細胞功能[6]。由干擾素誘導的干擾素誘導基因種類較多，如鳥苷酸結合蛋白、Mx、oligo（2-5A）合成酶、主要組織相容性復合物I類、II類和I11類基因、與血小板因子4相關的多肽家族、角蛋白K17、參與抗原呈遞的蛋白質(zhì)、吲哚胺2,3-雙加氧酶和IFP 53/trypto-phanyl-tRNA合成酶等[7-8]。干擾素誘導蛋白35（interferon induced protein 35，ifi35）屬于干擾素誘導蛋白的一種，哺乳動物人ifi35作為1.4 kb的單一mRNA種類存在，其中亮氨酸拉鏈結構域（leucine zipper domains，LZD）可促使基本區(qū)亮氨酸拉鏈（Basic region leucine zipper，bZIP）轉錄因子二聚化，形成1個鄰近富含堿性氨基酸的雙邊DNA結合區(qū)[9]。ifi35另外2個相同的NMI/IFP 35結構域（NID）串聯(lián)重復，介導NMI-NMI蛋白質(zhì)相互作用和亞細胞定位[10]。目前ifi35的功能研究主要集中在哺乳動物當中，低等脊椎動物、魚類ifi35的研究還非常欠缺。

尼羅羅非魚（）作為聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的世界性養(yǎng)殖品種，近年來養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)受到各種病原菌威脅，如細菌、寄生蟲、病毒等，尤其是近年來在全世界爆發(fā)的羅非魚羅湖病毒，給行業(yè)造成巨大損失[11-14]。因此，研究羅非魚機體抗病毒機制，對于將來羅非魚疾病防治具有重要作用。本研究通過克隆獲取羅非魚基因全長，對在健康羅非魚各組織的分布進行研究，對不同刺激物刺激后的表達特點進行分析，結果為進一步探究參與的機體免疫反應提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用健康尼羅羅非魚購自高州市朗業(yè)養(yǎng)殖場，體質(zhì)量約為50 g/尾。無乳鏈球菌（ZQ0910）菌種由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室保存提供。PolyI:C購自Sigma公司；克隆載體pMD18-T Vector、rTaq、Premix Taq購自TaKaRa公司(大連)；Trans1-T1感受態(tài)細胞、RNA提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒和qPCR試劑購自北京全式金生物技術有限公司；DNA 凝膠回收純化試劑盒購自Thermo Fisher公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚總RNA的提取和cDNA的合成 羅非魚在實驗室條件下(28 ± 2) ℃暫養(yǎng)1周后，無菌條件下取皮膚、頭腎、鰓、腦、體腎、腸、肌肉、心臟、肝、胸腺和脾11個組織，各取羅非魚3尾，每尾魚作為1個平行，放入2 mL凍存管中，液氮速凍后–80 ℃保存，用于基因克隆和用于不同組織表達分析。

對于刺激實驗設置取樣。無乳鏈球菌刺激組：腹腔注射濃度為1×107cfu/mL的無乳鏈球菌0.1 mL；polyI:C刺激組：腹腔注射濃度為100 μg/mL的polyI:C 0.1 mL；對照組：腹腔注射0.1 mL的磷酸緩沖液（PBS），分別在 0、3、6、12、24、48、72、96 h各取羅非魚3尾，每尾魚作為1個平行，取脾臟、體腎、頭腎和腸道組織，放入 2 mL凍存管中，液氮中保存。根據(jù) TransZol Up Plus RNA Kit說明書提取羅非魚各組織RNA。按照北京全式金公司的 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix 說明書將提取到的羅非魚各樣本的總 RNA反轉成 cDNA。

1.2.2 羅非魚基因的克隆 依據(jù)本實驗室羅非魚轉錄組數(shù)據(jù)，結合NCBI上公布的羅非魚基因組數(shù)據(jù)預測的基因序列，利用Primer 6.0設計On-ifi35基因引物（On-ifi35-1F：ATGATGCGCCTTTGTGTTTTTC）、（On-ifi35-1125R：TCACACTTTTCTGCTCTTTACTCTAGA），以1.2.1制備的羅非魚脾臟cDNA為模板，然后進行PCR擴增，PCR 反應體系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7.5 μL，cDNA 模板0.5 μL，On-ifi35-1F 1 μL，On-ifi35-1026R 1 μL。PCR 反應條件設置為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后對其進行切膠回收，目的條帶與pMD 18-T載體進行連接，轉化至Trans1-T1感受態(tài)細胞中，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)，然后離心濃縮細菌培養(yǎng)液至100 μL培養(yǎng)基中，將其均勻涂布于含100 ng/μL濃度Amp+的LB瓊脂糖固體平板上，倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 ~10 h，挑選單菌落于含 Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)3 ~ 5 h，用pMD 18-T載體上的通用引物（M13：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；RV：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGA）進行菌落 PCR鑒定，將陽性克隆送至生工生物公司測序。

1.2.3基因的生物信息學分析 對克隆獲得的cDNA序列使用NCBI (https://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列比對分析；利用ExPASy ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/）進行On-ifi35氨基酸序列推導和相關理化性質(zhì)分析；通過TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs. dtu. dk/services/TMHMM)進行跨膜結構域預測；通過Inter ProScan Sequence search (http://www.ebi.ac.uk/Tools)和SMART(http:// smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白功能結構域分析；通過Clutalx和Genedoc軟件進行氨基酸同源序列比對分析。通過MEGA6.0 軟件，用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 qRT-PCR檢測的表達 qRT-PCR實驗參考本實驗室方法[15]。首先利用的特異性引物（On-ifi35-qF：TAACGGAAGAAAGGTGGC）、（On-ifi35-qR：GTGTTCCAGGTGGTATCG）。以為內(nèi)參基因（β-actin-F: AACAACCACACACCACACATTTC，β-actin-R:TGTCTCCTTCATCGTTCCAGTTT），使用ABI 7500 Real-Time定量PCR儀檢測在各個組織以及不同刺激后的表達分析。qPCR 參照TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進行，反應體系：TransStart Top Green qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.5 μL，dH2O 3.7 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。每個樣本設置3個復孔。用 2-ΔΔCt方法計算相對表達量。此外，在羅非魚各組織中分布的檢測中，把皮膚組織表達量作為1，各個組織的相對表達量=每個組織的表達量/皮膚組織的表達量。在刺激組中，各組織相應時間點的相對表達量=實驗組各組織相應時間點的表達量/對照組織相應時間點的表達量。

2 結果

2.1 On-ifi35的序列特征

克隆獲得的（GenBank 登錄號: MF975639）基因全長為1 125 bp，可編碼374個氨基酸，預測蛋白分子質(zhì)量為42.79 ku，等電點為5.01。將On-ifi35基因與NCBI上基因組序列比對發(fā)現(xiàn)，On-ifi35基因組位于羅非魚的第四號染色體上，由 10個外顯子和9個內(nèi)含子組成（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?LinkName=protein_gene&from_uid=348510241）。序列分析表明，On- ifi35 含有1個LZD結構域（19-36-43-53-66 aa）和2個NID結構域（162-249aa，261-347aa）（圖 1）。利用ClustalW2 軟件，將On-ifi35氨基酸序列與其它物種的ifi35氨基酸序列進行同源性比對，結果發(fā)現(xiàn)On-ifi35與其它物種的相似性在35.23% ~ 93.32%之間（圖 2），其中On-ifi35與同是鱸形目慈鯛科的淡水魚類斑馬擬麗魚同源性較高，而與高等哺乳動物鼠的ifi35同源性較低。利用 Mega 6.0軟件的 Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示哺乳動物與魚類的ifi35聚為2個不同的分支，且羅非魚的ifi35與斑馬擬麗魚的ifi35聚為1支，具有最近的親緣關系（圖 3）。

下劃線表示LZD結構域（19-36-43-53-66 aa），灰色背景表示Nmi/IFP 35 結構域 (NID)（162-249 aa，261-347 aa）

GenBank 登錄號 (accession numbers): O.niloticus XP_003442654.1; M.zebra XP_004552562.1; M.albus XP_020461212.1; O.latipes XP_023813097.1; L.crocea XP_010744566.3; O.mykiss XP_021414073.1; S.salar NP_001135293.1; H.sapiens XP_016880073.1; M.musculus NP_081596.1

圖3 鄰位相連法構建ifi35氨基酸系統(tǒng)進化樹

2.4 On-ifi35在羅非魚各組織中的分布

的各組織表達檢測結果（圖4）顯示，在健康羅非魚的11個組織中均能表達，且在脾臟組織中表達量最高，其次是胸腺、肝臟、心臟、肌肉、腸道、體腎、腦、鰓、頭腎、在皮膚中表達量最低。

SK：皮膚；HK：頭腎；G：鰓；B：腦；K：體腎；I：腸；M：肌肉；H：心臟；L：肝；T：胸腺；S：脾；On-ifi35在皮膚中的表達量設為1。

2.5 無乳鏈球菌刺激后On-ifi35在羅非魚各組織中的表達

無乳鏈球菌刺激羅非魚后，用qRT-PCR檢測在脾臟、腸道、體腎和頭腎等4個組織中的時序表達。結果如圖5顯示，在脾臟組織中的表達量呈現(xiàn)先升高再降低，最后恢復到正常水平的變化，其中3 h顯著性增加(< 0.05)，而在24 h顯著性降低(< 0.05)；在腸道和頭腎組織中的表達量呈現(xiàn)先升高再降低的變化，其中在腸道組織中，3 h極顯著增加(< 0.01)，12h顯著性增加(< 0.05)；在頭腎組織中，3 h和6 h均顯著性增加(< 0.05)；在體腎組織中的表達量呈現(xiàn)先降低再升高的變化，其中，6 h、12 h和24 h均極顯著降低< 0.05)。

2.6 PolyI:C刺激后On-ifi35在羅非魚各組織中的表達

同樣的，PolyI:C刺激羅非魚后，用qRT-PCR檢測在脾臟、腸道、體腎、頭腎四個組織中的時序表達，結果如圖6顯示，的表達量均呈現(xiàn)先升高再降低，最后恢復到正常水平的變化，其中在脾臟組織3 h顯著性增加(<0.05)，在腸道和頭腎組織中，3 h和6 h都發(fā)生了極顯著增加(<0.01)，在體腎組織中，3 h極顯著增加(<0.05)。

*: 差異顯著(< 0.05); **: 差異極顯著(< 0.01)；在各個對照中的表達量均設為1

*: Significant difference (< 0.05); **: Very significant difference (< 0.01); Expression level of On-ifi35 in each control was set as 1

圖5 無乳鏈球菌刺激后在不同組織的時序表達

Fig. 5 Expression analysis ofin different tissues after stimulated by

*: 差異顯著(P < 0.05); **: 差異極顯著(P < 0.01)；On-ifi35在各個對照中的表達量均設為1

3 討論

本研究首先克隆獲得的基因全長為1 125 bp，編碼 374 個氨基酸，通過與NCBI上公布的基因組序列比對發(fā)現(xiàn)，位于羅非魚的第四號染色體上，由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成。且與高等哺乳動物人類ifi35相同，整個基因組中只有一個單拷貝[9]，暗示其功能在進化過程中未發(fā)生較大的擴張。序列分析表明，On-ifi35含有1個LZD結構域（19-36-43-53-66 aa）和2個NID結構域（162-249 aa，261-347 aa）。哺乳動物中，LZD結構域可促使bZIP轉錄因子二聚化，形成一個鄰近富含堿性氨基酸的雙邊DNA結合區(qū)。NID大約由90 ~ 92個氨基酸構成，該結構域在每個蛋白質(zhì)中串聯(lián)重復，并介導NMI-NMI蛋白質(zhì)相互作用和亞細胞定位[10]。羅非魚ifi35同樣具有保守的NID和LZD結構域，暗示ifi35從高等哺乳動物到低等脊椎動物魚類的功能具有相似性。多序列比對顯示，On-ifi35與同是鱸形目慈鯛科的淡水魚類斑馬擬麗魚具有93.32 %的同源性，而與哺乳動物人和鼠同源性相對較低，但是重要結構域比較保守，系統(tǒng)進化樹分析顯示，羅非魚的ifi35與斑馬擬麗魚的ifi35聚為1支，具有最近的親緣關系（圖 3）。綜上所述，本研究所獲得的羅非魚ifi35是ifi35家族的一員。

人在不同細胞群如上皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和角質(zhì)形成細胞中均可表達。ifi35的同源物NMI，在許多被檢測的細胞系中（來源于肝、腎、T細胞、B細胞、前列腺、子宮和宮頸的腫瘤）均可表達，且NMI蛋白的最高水平在胸腺、脾臟和肝臟[16]。目前在魚類當中還未有表達的分析。本研究通過實時熒光定量PCR分析顯示，在健康羅非魚各組織中均有表達，其中在脾臟組織中表達量最高，其次是胸腺、肝臟、心臟、肌肉、腸道、體腎、腦、鰓、頭腎，在皮膚中表達量最低。脾臟、胸腺組織作為羅非魚重要的免疫器官，還有大量T細胞和B細胞，與哺乳動物的同源物NMI的分布類似。PolyI:C作為病毒類似物刺激魚體后，機體會產(chǎn)生抗病毒的免疫反應[17]。而ifi35作為調(diào)節(jié)干擾素表達的關鍵分子，在機體應答外源物刺激后的表達特點還未有相關的文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無乳鏈球菌和PolyI:C刺激后，的表達量在羅非魚的脾臟、腸道、體腎和頭腎中均發(fā)生顯著性變化且呈現(xiàn)出明顯的時序性，此結果表明，在魚體抵抗細菌和病毒感染過程中均可發(fā)揮一定作用。然而體腎組織作為魚體的重要排泄器官，2種刺激物刺激后的表達模式呈現(xiàn)相反的時序依賴性，推測可能由于機體應對2種不同外源物質(zhì)產(chǎn)生了不同的應答機制，但是具體原因需要進一步研究。

4 結論

本研究克隆獲得基因全長序列，通過結構域分析、序列比對以及系統(tǒng)進化樹分析表明，所獲基因是ifi35家族成員。在健康羅非魚各組織中均有表達，無乳鏈球菌和PolyI:C刺激羅非魚后，在脾臟、腸道、體腎和頭腎等4個組織中的表達量均呈現(xiàn)顯著性變化。

[1] STARK GR, KERR IM, WILLIAMS BRG, et al. HOW CELLS RESPOND TO INTERFERONS - Annual Review of Biochemistry[J]. Annual Review of Biochemistry, 1998, 67(1): 227-264.

[2] THEOFILOPOULOS A N, BACCALA R, BEUTLER B, et al. TYPE I Interferons (alpha/beta) in immunity and autoimmunity[J]. Annual Review of Immunology, 2005, 23(1): 307-336.

[3] QI Z, NIE P, SECOMBES C J, et al. Intron-Containing Type I and Type III IFN Coexist in Amphibians: Refuting the Concept That a Retroposition Event Gave Rise to Type I IFNs[J]. The Journal of Immunology, 2010, 184(9): 5038-5046.

[4] ZOU J, SECOMBES C J. Teleost fish interferons and their role in immunity[J]. Developmental and comparative immunology, 2011, 35(12): 1376-1387.

[5] ZOU J, CARRINGTON A, COLLET B, et al. Identification and bioactivities of IFN-gamma in rainbow trout: the first Th1-type cytokine characterized functionally in fish.[J]. Journal of Immunology, 2005, 175(4): 2484-2494.

[6] HOWELL M D, SINGH N N, SINGH R N. Advances in therapeutic development for spinal muscular atrophy[J]. Future medicinal chemistry, 2014, 6(9): 1081-1099.

[7] RUFFNER H, REIS L F, N?F D, et al. Induction of type I interferon genes and interferon-inducible genes in embryonal stem cells devoid of interferon regulatory factor 1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1993, 90(24): 11503-11507.

[8] CHANG Y E, LAIMINS L A. Microarray analysis identifies interferon-inducible genes and Stat-1 as major transcriptional targets of human papillomavirus type 31[J]. Journal of virology, 2000, 74(9): 4174-4182.

[9] BANGE F C, VOGEL U, FLOHR T, et al. IFP 35 is an interferon-induced leucine zipper protein that undergoes interferon-regulated cellular redistribution[J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(2): 1091-1098.

[10] LEE N D, CHEN J, SHPALL R L, et al. Subcellular localization of interferon-inducible Myc/stat-interacting protein Nmi is regulated by a novel IFP 35 homologous domain[J]. Journal of interferon & cytokine research, 1999, 19(11): 1245-1252.

[11] BIGARRé L, CABON J, BAUD M, et al. Outbreak of betanodavirus infection in tilapia,(L.), in fresh water[J]. Journal of fish diseases, 2009, 32(8): 667-673.

[12] 郭建紅, 蔡穎, 吳松浩. 羅湖病毒研究進展[J]. 中國動物檢疫, 2017, 34(8): 72-75.

[13] 方秋紅, 毛雅瓊, 黃裕, 等. 羅非魚常見寄生蟲病及防治方法[J]. 漁業(yè)致富指南, 2011 (1): 46-48.

[14] 王蓓, 黎源, 陳賀, 等. 我國華南地區(qū)羅非魚源無乳鏈球菌分子流行病學研究[J]. 水產(chǎn)科學, 2014, 33 (12): 791-799.

[15] HUANG Y, ZHENG Q, NIU J, et al. NK-lysin fromimproves antimicrobial defence against bacterial pathogens[J]. Fish & shellfish immunology, 2018, 72: 259-265.

[16] LEBRUN S J, SHPALL R L, NAUMOVSKI L. Interferon-induced upregulation and cytoplasmic localization of Myc-interacting protein Nmi[J]. Journal of interferon & cytokine research, 1998, 18(9): 767-771.

[17] ZHENG W, LIU G, AO J, et al. Expression analysis of immune-relevant genes in the spleen of large yellow croaker () stimulated with poly I: C[J]. Fish & shellfish immunology, 2006, 21(4): 414-430.

Cloning and Expression Analysis ofin Nile Tilapia ()

HUANG Yu1,2,3, MA Jia-lin1, ZHOU Mian-xin1, CHEN Min-qi1, CAI Jia1,2,3, JIAN Ji-chang1,2,3, TANG Ju-fen1,2,3

（1.// 2.// 3.,524088,）

To investigate the role of interferon induced protein 35 (ifi 35) in the immune response of.The open reading frame of tilapiagene (GenBank accession number: XM_003442606;) was cloned and the distribution ofin different tissues of healthy tilapia and stimulation with different stimuli was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.gene is 1125 bp, encoding 374 amino acids, the theoretical molecular mass is 42.79 ku, and the isoelectric point is 5.01. On-ifi 35 contains one LZD domain and two Nmi/IFP 35 domain (NID). Multiple sequence alignment revealed that On-ifi 35 shared 35.2% - 93.3% sequence homology with ifi 35 from other species, and had the highest homology with. Phylogenetic analysis results indicate that On-ifi 35 was clustered with ifi 35 of the. Real-time quantitative PCR analysis showed thatwas expressed in all tissues of healthy tilapia. The highest expression was found in the spleen, followed by thymus, liver, heart, muscle, intestine, body kidney, brain, gill and head kidney. The lowest expression level was in the skin. After stimulation withagalactiae and PolyI:C, the expression level ofwas significantly changed in the spleen, intestine, mid-kidney and head kidney.

;; gene; cloning; expression

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2020）02-0013-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.003

2019-08-15

國家自然科學基金(31572651)；廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項目(230419083)

黃瑜（1986－），男，講師，博士，研究方向為魚類免疫學。 E-mail: huangyu@gdou.edu.cn

湯菊芬（1964－），女，高級工程師，碩士，研究方向為水產(chǎn)動物病害防治。E-mail：tjf10002000@163.com

黃瑜，馬嘉霖，周棉鑫，等. 羅非魚干擾素誘導蛋白35基因克隆及表達分析[J].廣東海洋大學學報，2020，40（2）：13-19.

（責任編輯：劉嶺）