廖 偉， 劉大慶， 馮承蓮,*， 金小偉， 劉 娜， 白英臣,， 吳代赦

1.南昌大學資源環(huán)境與化工學院， 鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室， 江西 南昌 330031 2.中國環(huán)境科學研究院， 環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室， 北京 100012 3.江西省灌溉試驗中心站， 江西 南昌 330201 4.中國環(huán)境監(jiān)測總站， 北京 100012

環(huán)境中的重金屬具有持久性和不可降解性，水域水體、沉積物中一旦重金屬含量增高，將危及或危害水生生物的生存和繁衍. Cu雖然在生物機體細胞代謝中起重要作用[1]，但Cu (主要指Cu2+)同樣會對水生生物具有較高毒性[2-5]. 研究[2,6-7]發(fā)現，我國太湖、遼河、鄱陽湖等水域重金屬污染的生態(tài)風險均較高，其中Cu為潛在風險最大的重金屬元素之一，故選擇Cu作為目標污染物具有重要意義.

目前，大部分研究主要考慮水質因素如硬度[8-11]、pH[12-13]、溶解性有機碳(DOC)[12,14-16]等對重金屬污染物生物有效性的影響，而極少考慮水生生物不同生長階段群體對污染物響應的差異. 在進行水環(huán)境基準推算時，大部分環(huán)境管理文件提到原則上選擇最敏感生長階段的毒性數據來推導基準值. 常用的水生生物，如蝦的各生長階段變化明顯，相關研究較多，但不同受試生物對污染物的最敏感生長階段不同. 而魚作為最重要的水生生物類群之一，不同生命階段對污染物敏感性的研究較少，所以選取合適的模式生物，合理區(qū)分其不同生長階段，研究污染物對其不同階段毒性差異具有重要意義.

斑馬魚屬鯉科，具有生長周期短、繁殖能力強、對污染物敏感等特點，是研究水生生物毒性效應良好的模式生物之一. 目前我國已建立了斑馬魚國家資源中心，廣泛用于各種重金屬、有機物等化學物質的毒性測試[17-21]. 現有研究僅將斑馬魚分為胚胎、幼魚、成魚3個階段[22-24]來比較污染物對其毒性的差異，但并未提及階段劃分的依據. 斑馬魚早幼期生長發(fā)育速度快，易受外界干擾，僅分為胚胎、幼魚、成魚3個階段難以代表斑馬魚生命周期不同階段對待測有毒化合物敏感性的變化，因此，有必要對斑馬魚早幼期不同階段進行細分，進一步研究其對有毒化合物敏感性的差異變化.

該研究旨在探索我國常見的且已大規(guī)模使用的模式生物斑馬魚不同生長階段劃分及分階段培養(yǎng)方法，并研究不同生長階段斑馬魚對Cu2+的毒性響應差異，以期為污染物生態(tài)風險評價和水質基準研究中對受試生物不同階段的選取提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚：受試生物為AB品系斑馬魚(Daniorerio)，購于中國科學院水生生物研究所，已在實驗室馴養(yǎng)5 a以上.

CuSO4·5H2O(五水合硫酸銅，GR)購自上海國藥試劑廠；Cu標準溶液購于國家標準物質網；CaCl2·2H2O(氯化鈣，AR)、MgSO4·7H2O(硫酸鎂，AR)、NaHCO3(碳酸氫鈉，AR)、KCl(氯化鉀，AR)等試劑均購自上海國藥試劑廠；豐年蝦休眠卵購自天津豐年水產養(yǎng)殖有限公司. 試驗用所有容器均放入酸桶(10%～15%鹽酸)浸泡24 h，再用自來水、除氯水沖洗干凈.

1.2 主要儀器

MGC-350 HP-2人工智能氣候箱(上海一恒科學儀器有限公司)；CASA流水養(yǎng)殖系統(tǒng)(無錫中科水質環(huán)境技術有限公司)；Leica M165C體式顯微鏡(徠卡微系統(tǒng)有限公司)；Mettler Toledo XPE205電子天平〔瑞士梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司〕；Milli Q Direct8試驗超純水機〔默瑞(上海)生物科技有限公司〕；Agilent7500a電感耦合等離子體質譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；YSI Professional Plus多參數水質分析儀〔維賽儀器貿易(上海)有限公司〕；PHS-3E精密pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司).

1.3 斑馬魚培育方法

斑馬魚親魚飼養(yǎng)：置于流水養(yǎng)殖系統(tǒng)，飼養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃、光強 1 000 lx、光暗比為16 h∶8 h. 水源為普通自來水經過活性炭過濾曝氣后注入流水養(yǎng)殖系統(tǒng)，水質硬度為(130±10)mg/L，pH為7.7±0.2，ρ(DO)>6 mg/L.

斑馬魚繁殖：夜晚將待產卵親魚放入孵化盒中，每個孵化盒放置兩雄、兩雌，第2天即可產卵.

根據斑馬魚的培養(yǎng)方法[25]、標準試驗方法[26-27]及實驗室觀察，該研究將斑馬魚生命周期劃分為8個不同階段(見表1).

表1 不同生長階段斑馬魚劃分描述

斑馬魚孵化：將斑馬魚受精卵收集到盛有曝氣自來水(經0.45 μm濾膜過濾)的結晶皿中，加入約0.01%的亞甲基藍試劑，置于光強為 1 000 lx、光暗比為16 h∶8 h、溫度為(28±1)℃下孵化. 孵化密度以每0.5 L水放入60～80枚受精卵為宜，每6～8 h觀察1次，視情況換水. 該方法下，實驗室斑馬魚受精卵 48～72 h可全部孵化，平均孵化率高于95%.

仔、幼魚飼養(yǎng)：孵化3～4 d后喂食經碾磨的初孵化豐年蝦碎末及少量新鮮蛋黃水；7～8 d喂食初孵化豐年蝦，每天換水1次；14 d后放入流水養(yǎng)殖系統(tǒng)與成魚同條件飼養(yǎng).

成魚飼養(yǎng)：流水養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)，早晚喂食孵化豐年蝦，培養(yǎng)條件與親魚一致.

孵化10 d后斑馬魚累積平均成活率為85.3%±4.5%，10 d后不同生長階段斑馬魚平均成活率均高于95.0%，滿足試驗方法中對受試生物成活率的要求.

1.4 斑馬魚生長監(jiān)測

每個監(jiān)測階段至少設置6個平行組，監(jiān)測環(huán)境條件、飼養(yǎng)密度、喂食量等與試驗受試魚相同，各階段成活率采用拍照計數的方法進行測定. 斑馬魚體長測定：孵化0～17 d內采用拍照投影的方法測量，17 d后用直尺測量. 斑馬魚體質量測定：孵化0～17 d內一次稱量5～200尾斑馬魚，再求其平均質量；17 d后直接稱量單尾魚質量. 斑馬魚各生長指標見式(1)～(3).

魚體長日均增長率(GL)計算公式：

(1)

體質量日均增長率(GW)計算公式：

(2)

斑馬魚質量指數(BMI)計算公式：

BMI=WILI2

(3)

式中：LI為某生長階段初始體長，mm；LF為某生長階段末體長，mm；WI為某生長階段初始體質量，g；WF為某生長階段末體質量，g；N為某生長階段天數，d.

1.5 毒性暴露試驗方法

斑馬魚急性毒性試驗嚴格按照毒性試驗操作進行[26-27]. 采用單因子急性毒性測試方法，試驗周期為96 h，不同生長階段斑馬魚魚齡偏差均小于12 h(其中1 d幼魚魚齡偏差小于6 h)，根據魚大小選擇不同直徑的結晶皿或大燒杯，保證暴露液中魚的密度不超過0.5 g/L. 暴露試驗標準稀釋水按照標準試驗方法[26]要求配制，水體硬度為250 mg/L (以CaCO3計)，模擬自來水則根據實驗室自來水鈣鎂離子的濃度，配制成硬度約為125 mg/L (以CaCO3計)的重組水. 使用前充分曝氣24 h，ρ(DO)>6.0 mg/L，pH為7.8±0.2，符合標準試驗方法[26]要求. 每個暴露濃度均設置3個平行，每個平行均放入10尾斑馬魚，采用半靜態(tài)試驗方法，每24 h更換暴露液，以保證受試物質的穩(wěn)定性及DO合格，暴露期間水溫、光照與培養(yǎng)條件保持一致. 試驗期間觀察24、48、72、96 h魚的死亡(用玻璃棒輕觸魚的尾部，沒有反應即認為已死亡)情況，并記錄每個容器中魚死亡的數目，清出死魚. 試驗過程中，所有死亡以及試驗后未死亡的魚均收集冷凍待集中處理. 試驗期間，所有空白試驗組斑馬魚死亡率均為0；經電感耦合等離子體質譜儀測量，Cu2+暴露液濃度實測值與理論值相差小于6%.

1.6 數據收集和篩選

Cu的水生生物毒性數據主要來源于已公開發(fā)表的學術論文[6-7,28]，并檢索2014—2018年US EPA的毒性數據庫ECOTOX (http://cfpub.epa.gov/ecotox)、Web of Science和中國知網等文獻數據庫公開發(fā)表的文獻數據作為補充. 毒性數據篩選規(guī)則參考 HJ 831—2017《淡水水生生物水質基準制定技術指南》[29]及文獻[30]，數據篩選后僅保留我國本土物種的毒性數據進行比較.

1.7 數據處理

采用SPSS 22.0軟件Probit方法計算暴露試驗的LC50(半致死濃度)及其95%置信區(qū)間，用Origin 8.0軟件制圖.

2 結果與分析

2.1 斑馬魚生長監(jiān)測

通過對不同性別斑馬魚體長、體質量數據進行模擬發(fā)現，logistic增長方程能較好地擬合斑馬魚雌魚、雄魚的體長與體質量之間變化規(guī)律(見表2).

不同生長階段斑馬魚各生長指標變化情況如圖1所示. 由圖1可見，斑馬魚在17～24 d內生長最快，90 d后斑馬魚體長增長率降至低點；120 d后斑馬魚體質量增長速率也降至最低，第120天斑馬魚質量指數與第90天時基本持平.

試驗監(jiān)測表明，在食物充足情況下，斑馬魚的體長、體質量變化均符合logistic增長方程，90 d后斑馬魚達到生殖水平. 第90天斑馬魚已接近成魚體長，而體質量方面，由于斑馬魚親魚繁殖需要，90 d后其體質量還保持一定的增長率. 由圖1可見，第150天斑馬魚體質量日均增長率高于第120天，除斑馬魚生殖能量儲備外，還一個重要原因是120 d后斑馬魚的飼養(yǎng)密度降低，減少了斑馬魚的生存環(huán)境壓力，使得體質量日均增長率及質量指數升高.

表2 斑馬魚體長與體質量之間的擬合結果

注：x為魚齡，d；y為體長或體質量，mm或g.

圖1 不同生長階段斑馬魚各生長指標變化情況Fig.1 The variation of indicators at different growth stages of zebrafish

由圖1可見：魚齡在10 d前，斑馬魚無論是體長率還是體質量的日均增長率率均十分緩慢；17 d后稚魚能主動捕食活體豐年蝦，并能快速吸收并合成自身需要的物質，此時斑馬魚稚魚體長日均增長率較10 d快速增加，且17 d時體質量日均增長率約是10 d的14倍；24 d時斑馬魚幼魚的體長、體質量日均增長率均為全生命周期最快的時期，此階段斑馬魚幼魚活動范圍較17 d時有了較大提高，外表體型均接近成魚；31 d后斑馬魚幼魚體長、體質量日均增長率較24 d時均有所下降，但體長日均增長率仍保持次高速率增長，體質量日均增長率較17和24 d時有所減緩，該階段斑馬魚幼魚活動范圍已涉及整個魚缸，能夠自由游動，外表進一步接近成魚；60 d時斑馬魚幼魚體長、體質量日均增長率較31 d時進一步放緩，體長已經達成魚體長的75%，體質量日均增長率仍然保持較高水平；90 d時斑馬魚體長、體質量日均增長率較60 d時進一步放緩，但由于斑馬魚體長和體質量基數大，該階段處于最大的絕對增長量；90 d后斑馬魚體長已經接近成魚平均水平，而體質量則在120 d后與成魚平均水平相當. 綜上，將斑馬魚分為仔魚階段(1 d、10 d)，稚魚階段(17 d)，幼魚階段(24、31、60 d)和成魚階段(90、120 d)，符合斑馬魚的生長規(guī)律.

2.2 不同生長階段斑馬魚對Cu2+的毒性差異

我國魚類急性毒性測試標準方法均采用硬度為250 mg/L的標準稀釋水溶液，但其與實際環(huán)境中水的硬度存在較大差異[31]，而水體硬度又是影響Cu2+水生生物毒性的重要因素之一[9,32-33]，故該研究根據實驗室自來水鈣鎂離子濃度，配制了硬度為125 mg/L的模擬自來水，分別研究標準稀釋水和模擬自來水下Cu2+對不同生長階段斑馬魚的毒性，結果如圖2所示.

圖2 不同水質條件下各生長階段斑馬魚對Cu2毒性的響應差異Fig.2 The toxicity response of zebrafish to Cu2+ at different growth stages under different water quality conditions

由圖2可見：標準稀釋水條件下，Cu2+對不同生長階段斑馬魚的毒性隨暴露時間的延長而逐漸增大，Cu2+對斑馬魚各階段24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50、96 h-LC50的幾何平均值分別為0.54、0.42、0.38和0.36 mg/L；從不同生長階段劃分來看，Cu2+對斑馬魚的96 h-LC50分別為0.425 mg/L (1 d)、0.768 mg/L (10 d)、0.550 mg/L (17 d)、0.309 mg/L (24 d)、0.334 mg/L (31 d)、0.327 mg/L (60 d)、0.230 mg/L (90 d)和0.180 mg/L (120 d)，表明隨著魚齡的增加，Cu2+對斑馬魚的毒性不斷增大，不同生長階段斑馬魚對Cu2+的敏感性順序為120 d>90 d>24 d>60 d>31 d>1 d>17 d>10 d.

由圖2可見：模擬自來水條件下，Cu2+對斑馬魚各生長階段的毒性隨暴露時間的延長而逐漸增大，Cu2+對斑馬魚各生長階段24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50、96 h-LC50的幾何平均值分別為0.36、0.28、0.25和0.24 mg/L；從不同生長階段劃分來看，Cu2+對斑馬魚的96 h-LC50分別為0.377 mg/L (1 d)、0.438 mg/L (10 d)、0.366 mg/L (17 d)、0.201 mg/L (24 d)、0.206 mg/L (31 d)、0.189 mg/L (60 d)、0.167 mg/L (90 d)和0.144 mg/L (120 d)，結果表明隨著魚齡的增加，Cu2+對斑馬魚毒性增大，不同生長階段斑馬魚對Cu2+的敏感性順序為120 d>90 d>60 d>24 d>31 d>1 d>17 d>10 d. 模擬自來水條件下，Cu2+對斑馬魚各生長階段毒性變化情況與標準稀釋水試驗結果一致.

2.3 不同生長階段斑馬魚毒性差異在Cu2+的物種敏感度分布變化

為研究不同生長階段斑馬魚對Cu2+敏感性差異在Cu物種敏感度分布圖中的變化情況，將Cu2+對不同生長階段斑馬魚96 h-LC50毒性數據加入Cu的物種敏感度分布圖中進行比較. 圖3為不同生長階段斑馬魚對Cu2+敏感性在Cu物種敏感度分布圖中的位置，其中每個點代表一個生物毒性數據，數據的毒性終點均為標準試驗下的LC50或EC50(半數效應濃度)，除斑馬魚外，其他物種不進行生長階段劃分. 物種敏感度分級參考文獻[34-36]：累積概率小于5%，屬于非常敏感；累積概率為5%～15%，屬于敏感；累積概率為15%～30%，屬于較敏感；累積概率為 30%～50%，屬于相對不敏感；累積概率大于50%，屬于不敏感.

注： DW—標準稀釋水； TW—模擬自來水. 除斑馬魚外，其他物種毒性數據來自文獻[6-7,28].圖3 不同生長階段斑馬魚在Cu物種敏感度分布Fig.3 Species sensitivity distributions for Cu2+ under different life-stage

由圖3可見：Cu2+對水生生物的急性毒性數據量為152個，該研究中最敏感的為模擬自來水下120 d成魚期斑馬魚(排序第37位)，累積概率為24.18%，屬于較敏感物種；標準稀釋水下120 d成魚期斑馬魚排在第50位，累積概率為32.68%，屬于相對不敏感物種；而10 d仔魚期斑馬魚在模擬自來水和標準稀釋水下的排序分別為第111和129位，累積概率分別為72.55%和84.31%，均屬于不敏感物種. 研究發(fā)現，不同生長階段斑馬魚對Cu2+的敏感性在Cu2+的物種敏感度分布中變化顯著，且成魚敏感性高于幼魚敏感性.

3 討論

由于發(fā)育完善程度、代謝速率等不同，生物的不同生長階段對污染物毒性響應的敏感性存在差異. 研究[37]表明，生物體在胚胎發(fā)育、性分化和性成熟期對污染物較敏感. 該研究將斑馬魚分為8個不同生長階段，發(fā)現1、24、90和120 d的斑馬魚均處于相對敏感期，但敏感性總體趨勢為成魚階段(120、90 d)>幼魚階段(60 、31、24 d)>卵黃囊仔魚期(1 d)>稚魚期(17 d)>晚期仔魚期(10 d).

蔣金花等[22]研究發(fā)現，三唑酮對斑馬魚毒性大小的規(guī)律為成魚(90 d)>幼魚(55 d)>仔魚(8 d)，與筆者研究結果一致. 程艷紅等[23]研究斑馬魚不同生長階段的急性毒性效應時發(fā)現，乙草胺、丁草胺對斑馬魚毒性大小表現為仔魚(8 d)>成魚(90 d)>幼魚(55 d)，丙草胺對斑馬魚毒性大小表現為仔魚(8 d)、成魚(90 d)>幼魚(55 d)，成魚敏感性大于幼魚敏感性，與該研究結論一致. 但仔魚(8 d)毒性敏感性與筆者研究結果不一致，這與不同實驗室的仔魚選取時間和養(yǎng)殖方式有較大關系，因為斑馬魚在8 d左右，其卵黃囊剛耗盡，失去卵黃囊提供營養(yǎng)物質，體弱的斑馬魚容易死亡，從而導致仔魚(8 d)敏感性增加.

大量研究表明，重金屬污染物對無脊椎動物毒性表現為幼年期大于成年期. 如Soegianto等[38-39]研究發(fā)現，幼蝦對Pb和Cu最敏感；Madhav等[40]研究發(fā)現，7 d鹵蟲藻對Cu最敏感，而成年鹵蟲藻對Cu最不敏感；Verriopoulos等[41]研究發(fā)現，Cu對橈足類水蚤的毒性大小表現為1 d>5 d>10 d. 由于重金屬對不同生長階段魚類致毒機理復雜，研究結果沒有特定的規(guī)律. TANG等[42]發(fā)現,Cu對15 d白鱘的毒性高于對48及139 d白鱘的毒性，但Cd對48 d白鱘的毒性高于對15和139 d白鱘的毒性. Mcnulty等[43]研究Cu對擬銀漢魚年齡特異性差異時發(fā)現，年齡在0、3、5 d的擬銀漢比年齡≥7 d的擬銀漢對Cu更不敏感，原因是魚在生長發(fā)育過程中由皮膚呼吸為主逐漸轉變?yōu)槿粑鼮橹?，隨著魚齡增大，增加腮損傷或功能障礙導致幼魚的敏感性增加，另外該研究表明擬銀漢魚早幼期階段腮的表面積增加超過7倍，而皮膚表面積在同一時期只增長了3倍. 該研究發(fā)現，Cu2+對斑馬魚各生長階段的毒性在10、17和24 d隨魚齡的增加而增大，24 d后無顯著差異，但31 d略高于24 d. Cu的主要致毒機理為游離Cu (Cu2+)進入細胞質膜，增加質膜的滲透性，引起鈉等其他離子流失，破壞離子平衡、提升血液粘度，造成心力衰竭等癥狀，導致生物死亡[19,44]. 在斑馬魚馴養(yǎng)過程中研究發(fā)現，斑馬魚孵化12 h后有50%的仔魚能平游，但前期生長十分緩慢，呼吸頻率低，且10 d仔魚基本靠卵黃囊維持生命. 該階段大部分斑馬魚死亡癥狀為畸形，失去游泳能力等，再停止心跳. 相對于發(fā)育相對完善的小魚來說，仔魚活動能力弱、新陳代謝慢，且主要靠皮膚與暴露液毒性離子接觸，從而減少了暴露液毒性離子進入魚體內的途徑，故該階段斑馬魚對暴露液毒性物質的敏感性低. 17 d后斑馬魚稚魚活動能力提升，捕食能力增強、活動頻率提高，新陳代謝加快，呼吸頻率較之前快，此時斑馬魚可能慢慢由皮膚接觸為主轉化為魚鰓接觸為主，所以17 d幼魚對Cu2+敏感性高于10 d幼魚. 但24、31 d幼魚對Cu2+的敏感性顯著高于17 d幼魚，斑馬魚在17 d后處于快速生長期，此時斑馬魚幼魚無論從體長還是體質量均高于前期[45]. 60 d后隨著斑馬魚體長和體質量的快速增加，其新陳代謝速率不斷加快，極大地增強了魚各組織(如魚鰓)與外界溶液的交流，90 d后斑馬魚性成熟，進入繁殖期，魚體對污染物的敏感性進一步增大，所以該研究中Cu2+對斑馬魚成魚的毒性大小為成魚階段>幼魚階段>稚魚階段>仔魚階段.

4 結論

a) 斑馬魚在食物充足情況下，體長、體質量的變化均符合logistic增長方程，90 d斑馬魚接近成魚平均體長，且達到生殖水平. 根據斑馬魚生長監(jiān)測結果確定斑馬魚的不同生長階段，即卵黃囊仔魚期(1 d)、晚期仔魚期(10 d)、稚魚期(17 d)、早幼期(24 d)、幼魚期(31 d)、發(fā)育期(60 d)、成熟期(90 d)、成魚期(120 d)等8個生長階段.

b) 從不同生長階段劃分來看，Cu2+對不同生長階段斑馬魚的毒性表現為120 d>90 d>24 d>60 d>31 d>1 d>17 d>10 d，隨著魚齡的增加，Cu2+對斑馬魚的毒性逐漸增大；將試驗數據結合文獻數據構成Cu2+的物種敏感度分布，結果顯示成魚期斑馬魚為較敏感物種，而晚期仔魚期斑馬魚為不敏感物種，受試生物的不同生長階段對污染物的敏感性存在較大差異.

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