祁靖宇, 薛琪琪, 柳春雨, 張倩,閆曉璐, 門麗娜,2*, 張志偉,2*

(1.山西農業(yè)大學林學院， 山西 太谷 030801； 2.山西省林業(yè)危險性有害生物檢驗鑒定中心， 山西 太谷 030801)

垂柳(Salixbabylonica)隸屬楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)，是一種落葉喬木，是我國常見樹種之一[1]。因其扦插成功率高，適應能力強，生長速度快，覆蓋面廣，且樹姿優(yōu)美極具觀賞價值，常被用于園林綠化、通道綠化、護堤抗洪、速生用材等方面，在西部的生態(tài)環(huán)境建設及植被恢復過程發(fā)揮重要作用[2-3]。然而近年來，柳厚壁葉蜂(Pontaniadolichura)的發(fā)生逐年加重，在垂柳葉片上形成蟲癭抑制其光合作用，減緩垂柳的生長發(fā)育，并嚴重影響垂柳景觀綠化效果。

柳厚壁葉蜂又稱柳癭葉蜂，屬于膜翅目(Hymenoptera)，葉蜂科(Tenthredinidae)，癭葉蜂屬(Pontania)，該蟲1年發(fā)生1代，主要分布在我國的中北部地區(qū)[4]，潛食垂柳葉片，被取食部位逐漸隆起形成蟲癭[5-6]。隨著癭內幼蟲的生長，取食量增加，蟲癭逐漸增厚變大[7]，受害樹枝不堪重負下垂變黃甚至脫落[8-9]，嚴重時，蟲癭聚連成串，受害葉片葉綠素含量顯著降低，嚴重影響光合作用，削弱垂柳的長勢，對垂柳的景觀綠化效果產生較大影響[10-12]。

由于柳厚壁葉蜂在整個為害時期都居于完全封閉的蟲癭內獲取寄主營養(yǎng)，不易觀察和研究，生長發(fā)育階段不易判斷，最佳防治時期也難以把握[13]。目前國內對蟲癭的研究主要集中于其形態(tài)結構及致癭昆蟲類型[14-15]，而致癭昆蟲生長發(fā)育和成癭機制尚不清楚。有研究推測，植物葉片受到致癭昆蟲分泌的唾液酶刺激而形成蟲癭[16-17]；也有研究認為，致癭昆蟲產卵時釋放的雌性激素及一些無機物可以刺激癭組織的產生[18-19]。Parr[20-21]和Plumb[22]應用致癭昆蟲的抽提混合物成功誘導產生蟲癭，然而把混合物中的某些物質單一注入寄主植物體內，均無法誘導生成蟲癭[23]。綜合來看，蟲癭系統學研究及多數學者皆認為蟲癭的形成與昆蟲行為有較大關系[24]，蟲癭的形態(tài)是致癭者為害的外在表現。為了進一步研究柳厚壁葉蜂幼蟲的生活習性，掌握其發(fā)生發(fā)育規(guī)律，本研究通過系統分析幼蟲形態(tài)與蟲癭形態(tài)的相關性，建立應用蟲癭的外部形態(tài)來科學預測其內部柳厚壁葉蜂幼蟲的生長發(fā)育狀態(tài)的線性模型，能夠為研究取樣和柳厚壁葉蜂最佳防治時期的選擇提供本底資料，為致癭昆蟲誘導成癭機制的研究提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇山西農業(yè)大學校園內帶蟲癭較多且蟲癭分布均勻的垂柳葉片上的蟲癭為研究對象。研究地點位于E 112°34′、N 57°25′，海拔約790 m。位于黃土高原東翼，屬于溫帶大陸性季風氣候，全年平均氣溫10 ℃，年均降水量為450 mm，年蒸發(fā)量約為1 740.5 mm[25]。

1.2 研究方法

由于柳厚壁葉蜂幼蟲生長在蟲癭內部，難以直接觀察，根據每個蟲癭內部有一頭幼蟲的特點，從2018年4月20日垂柳葉片剛剛發(fā)育開始，采用隨機取樣法，每3 d取樣一次，直至2018年10月30日柳厚壁葉蜂的老熟幼蟲脫癭、入土結繭越冬為止，共取樣55次。隨機剪取10片帶有蟲癭的新鮮垂柳葉片，于室內進行顯微測量。在Zeiss Stemi 2000-C體視鏡(卡爾蔡司，德國)下觀察并去除已經開縫的蟲癭，保留完整的蟲癭，記錄蟲癭在葉片上的位置，然后用體視鏡測量蟲癭長(gall length，GL)、蟲癭寬(gall width，GW)和蟲癭厚(gall thickness，GT)；用單面刀片沿蟲癭長軸的側面小心解剖蟲癭，測量蟲癭壁厚(wall thickness，WT)，以及蟲癭內的幼蟲體長(larva length，LL)、幼蟲體寬(larva width，LW)、幼蟲頭長(head length，HL)和幼蟲頭寬(head width，HW)。

1.3 柳厚壁葉蜂不同形態(tài)指標的主成分、DCA及回歸分析

為了探尋不同調查時期柳厚壁葉蜂生長發(fā)育過程最具代表性的蟲癭和幼蟲形態(tài)特征，按照剔除最小特征值主成分中對應的最大特征向量的變量原則[26]，對55個采集日期的柳厚壁葉蜂蟲癭長、蟲癭寬、蟲癭厚、蟲癭壁厚及幼蟲的體長、體寬、頭長、頭寬共8個形態(tài)特征指標進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，根據每個形態(tài)特征指標的標準化值及特征根、特征向量計算出各主成分值。因為主成分分析結果中各指標之間差異較小，為了顯示不同類型形態(tài)指標間的差異顯著度，將主成分進行方差最大化旋轉分析。

去除趨勢對應分析(detrended correspondence analysis，DCA)側重物種自身特征量的分布，只需一個矩陣即可[27-28]。將8個形態(tài)特征指標的55個調查時期數據，建立8×55數據矩陣，導入軟件Canoco 5.0[29-30]完成DCA排序。

對4個蟲癭形態(tài)指標之間、4個幼蟲形態(tài)指標之間以及蟲癭與幼蟲形態(tài)指標之間分別進行一元線性回歸分析。

1.4 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2019軟件記錄并整理測量數據，運用Canoco 5.0軟件進行主成分分析和DCA分析，用Sigmaplot 12.5軟件(Systat Software, Inc., San Jose California, USA)進行線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1 柳厚壁葉蜂蟲癭及幼蟲形態(tài)特征的主成分分析

柳厚壁葉蜂蟲癭及幼蟲形態(tài)特征的主成分分析結果(表1)顯示，前2個主成分的累計貢獻率分別達到88.13%、98.06%，即前2個主成分可以代表檢測指標的大部分信息，因此對前2個主成分進行進一步分析。

表1 主成分分析的特征值及貢獻率Table 1 Eigenvalues and contribution rates of principal component analysis

成分載荷矩陣反映各形態(tài)指標在主成分中的作用方向及大小程度。8個形態(tài)指標的主成分載荷矩陣見表2，可以看出，主成分1中，蟲癭及幼蟲的8個指標的載荷系數均較高；主成分2中，這8個變量的載荷系數均較低。其中蟲癭的4個形態(tài)指標在第1和第2主成分中均起負向作用。對兩個主成分進行旋轉后，第1主成分中蟲癭4個形態(tài)指標的載荷系數均較高，而幼蟲4個形態(tài)指標的載荷系數均較低。因此，第1主成分主要體現蟲癭的形態(tài)指標；第2主成分中幼蟲4個形態(tài)指標的載荷系數均較高，而蟲癭的形態(tài)指標載荷系數均較低，表明第2主成分主要代表幼蟲的形態(tài)指標。其中蟲癭壁厚對第1主成分的貢獻率最高，載荷系數為0.897，幼蟲體寬對第2主成分的貢獻率最高，載荷系數為0.907。

表2 主成分分析的載荷矩陣Table 2 Load matrix of principal component analysis

主成分分析的得分和載荷見圖1。其中的點代表不同發(fā)育時期8個形態(tài)指標綜合參數得分值，箭頭分別表示8個形態(tài)特征，箭頭所處的象限表示該形態(tài)特征與對應主成分相關性的正負值[31]?？梢?，不同發(fā)育時期的形態(tài)學綜合指標的得分值初步聚為三類，分布于4個象限中，說明不同調查時期柳厚壁葉蜂的生長發(fā)育規(guī)律差異明顯。調查日期4月20日和4月23日距離蟲癭及幼蟲的8個形態(tài)學指標均較遠，表明該時期柳厚壁葉蜂蟲癭及幼蟲的生長發(fā)育變化幅度較小。6—9月檢測點的得分值主要密集出現于第3象限，與蟲癭的長、寬、厚、壁厚均呈正相關，說明這個時期蟲癭的生長發(fā)育形態(tài)變化占主導地位，且在此期間，各形態(tài)指標集中分布于坐標軸中心附近，說明這個時期蟲癭和幼蟲的綜合形態(tài)學指標之間的相關性較強。10月檢測點的得分值處于第2象限，與幼蟲的體長、體寬、頭長、頭寬呈正相關，說明10月幼蟲的生長發(fā)育形態(tài)變化占主導地位。幼蟲的體長、體寬、頭長和頭寬均聚集于第2象限，表明幼蟲的形態(tài)指標與主成分1呈負相關，與主成分2呈正相關；蟲癭的長、寬、厚以及壁厚均聚集于第3象限，表明蟲癭的形態(tài)指標與主成分1和2均呈負相關。也可看出，幼蟲形態(tài)指標之間與蟲癭形態(tài)指標之間均表現為自相關。不同來源的形態(tài)指標之間，蟲癭厚與幼蟲體長的矢量夾角最小，說明二者相關性最強[32]。連線的長短表示該形態(tài)特征所能代表的形態(tài)指標的貢獻率大小。柳厚壁葉蜂幼蟲頭長的連線最短，說明幼蟲的頭長指標對幼蟲整體生長發(fā)育的貢獻率最??；而蟲癭及幼蟲的其余形態(tài)指標連線長度相似且都較長，表明這些特征的貢獻率較大。連線在對應主成分的斜率表示該形態(tài)特征與此主成分的相關性強弱，斜率越小，相關性越強?？梢?，蟲癭厚及幼蟲體長與主成分1的相關性較強，因而在柳厚壁葉蜂生長發(fā)育過程中可以用蟲癭厚及幼蟲體長分別代表蟲癭及幼蟲的生長發(fā)育狀況。

圖1 主成分分析的載荷及得分Fig.1 Load and score of principal component analysis

2.2 柳厚壁葉蜂蟲癭及幼蟲形態(tài)特征的去除趨勢對應分析

DCA排序可以反映各物種在主要生長梯度的分布特征，通過這些物種與排序軸的相關性分析找出與排序軸顯著相關的特征量。柳厚壁葉蜂蟲癭及幼蟲各形態(tài)特征的DCA分析結果見表3，可見，DCA前兩個排序軸的特征值分別為0.009 4、0.000 2，第1、2排序軸累計解釋方差為80.3%，大于70%[33]，表明這兩個排序軸可反映柳厚壁葉蜂蟲癭、幼蟲形態(tài)特征數據分布的基本全貌，即這兩個排序軸包含了大部分形態(tài)特征信息。因此采用第1、2排序軸的特征值，繪制二維排序圖。

表3 柳厚壁葉蜂蟲癭及幼蟲形態(tài)特征的DCA分析Table 3 DCA analysis of the morphological characteristic of the gall and larva of P. dolichura

DCA排序圖可以綜合反映物種和群落或物種和物種之間的相關程度及其在平面散點圖內的綜合對比關系[28]。由圖2A可知，幼蟲體寬數據位于第1象限，在x和y軸的投影都較大，表明該形態(tài)指標對柳厚壁葉蜂幼蟲的生長發(fā)育形態(tài)貢獻率較大；蟲癭壁厚數據位于第4象限，在y軸的投影較大，表明該指標對蟲癭生長發(fā)育形態(tài)貢獻率較大。蟲癭厚這一指標在x和y軸的投影均較小，表明該指標對蟲癭生長發(fā)育的貢獻率較小。從圖2A也可明顯看出，幼蟲體寬和蟲癭壁厚這兩個指標與其他形態(tài)指標距離較遠，說明這兩個指標與其他形態(tài)指標的相關性較差。對角線基本反映了蟲癭和幼蟲形態(tài)特征的變化規(guī)律，即第2、3象限主要是蟲癭的形態(tài)特征，逐漸過渡至以幼蟲形態(tài)特征為主的第1象限。DCA得分(圖2B)中，DCA第一軸主要反映了調查時期的進程，第二軸主要反映了從蟲癭生長發(fā)育為主逐漸到幼蟲的生長發(fā)育為主的變化過程。調查日期4月20日和4月23日處于x軸最左端，而調查日期10月12日—10月30日處于x軸最右端，基本反映出沿著DCA的x軸從左到右，逐漸由春季向秋季轉變的趨勢。形態(tài)數據在調查時間上明顯可以分為3段：4月23日之前，4月26日—9月29日和10月12日之后，這與PCA分析結果一致。

2.3 蟲癭各形態(tài)指標之間的自相關分析

對蟲癭的4個形態(tài)指標之間進行自相關分析，結果見圖3，可見，在研究期內，蟲癭寬(x)和蟲癭厚(y)的線性回歸方程為y=1.283x-2.297 (R2=0.942，P<0.000 1)。蟲癭長(x)和蟲癭寬(y)的線性回歸方程為y=0.917x-1.997 (R2=0.908，P<0.000 1)。蟲癭厚與蟲癭寬之間、蟲癭長與蟲癭寬之間也均呈顯著線性相關關系，兩個線性方程的R2皆大于0.90，P值均小于0.000 1，蟲癭其余形態(tài)指標之間的R2值均大于0.80，且P值均小于0.000 1。說明柳厚壁葉蜂蟲癭各形態(tài)指標兩兩之間的線性關系較為可靠。因此，蟲癭各形態(tài)指標之間，可以根據線性回歸方程進行相互轉換，這為蟲癭形態(tài)變化規(guī)律的研究奠定了基礎，也為判斷柳厚壁葉蜂幼蟲生長發(fā)育規(guī)律提供強有力的數據支撐。

圖3 柳厚壁葉蜂蟲癭各形態(tài)指標之間的線性回歸分析Fig.3 Linear regression analysis between gall morphological indexes of P. dolichura

2.4 幼蟲各形態(tài)指標之間的自相關分析

對柳厚壁葉蜂幼蟲的4個形態(tài)指標兩兩之間進行自相關分析，結果見圖4，可見，在研究期內，柳厚壁葉蜂幼蟲各形態(tài)指標之間存在顯著線性關系，幼蟲體長(x)與體寬(y)的回歸方程為y=0.190x-0.111(R2=0.980，P<0.000 1)；幼蟲體長(x)與頭寬(y)的回歸方程為y=0.117x+0.092(R2=0.966，P<0.000 1)；幼蟲體寬(x)與頭寬(y)的回歸方程為y=0.605x+0.168(R2=0.958，P<0.000 1)；幼蟲體長與體寬、體長與頭寬、體寬與頭寬的線性回歸的R2值均高于0.95，P值均小于0.000 1。因此，幼蟲的形態(tài)指標之間均存在一定的線性關系，可以根據線性回歸方程進行相互轉換。

圖4 柳厚壁葉蜂幼蟲各形態(tài)指標之間的線性回歸分析Fig.4 Linear regression analysis between larva morphological indexes of P. dolichura

2.5 蟲癭與幼蟲代表形態(tài)特征之間的線性關系

由于蟲癭、幼蟲各形態(tài)特征指標之間的自相關很強，并基于PCA和DCA分析結果，選擇蟲癭厚和幼蟲體長分別作為蟲癭形態(tài)特征和幼蟲形態(tài)特征的代表，進行蟲癭和幼蟲形態(tài)指標的線性回歸分析，結果見圖5A，可見蟲癭厚和幼蟲體長間存在顯著的線性關系，R2為0.511。可以看出，發(fā)育前期形態(tài)測量數據點的分布較為聚集，而發(fā)育后期，幼蟲的形態(tài)測量數據出現劇烈增長趨勢，表現出明顯的形態(tài)數據分段規(guī)律。進一步對發(fā)育前期的數據進行線性分析，結果見圖5B，可見，當幼蟲體長小于等于6.90 mm時，蟲癭厚(y)與幼蟲體長(x)的線性回歸方程為y=1.771x+0.653 (R2=0.920，P<0.000 1)，線性關系顯著，這與PCA結果一致。因此，蟲癭厚和幼蟲體長的線性關系表現為明顯的條件函數關系。進一步對蟲癭與幼蟲的其他形態(tài)特征進行分析，發(fā)現蟲癭與幼蟲各形態(tài)指標之間均存在條件函數關系，在幼蟲發(fā)育初期至中期存在顯著的線性關系；在幼蟲發(fā)育后期，幼蟲的形態(tài)指標突然變大，即老熟階段[25]，幼蟲形態(tài)呈現跳躍式增長。

3 討論

本研究運用主成分分析、去除趨勢對應分析以及線性回歸分析方法對柳厚壁葉蜂幼蟲生長發(fā)育與蟲癭增長的相關性進行研究。主成分分析中，雖然蟲癭壁厚和幼蟲體寬分別對蟲癭和幼蟲的貢獻率最高，但是這兩個形態(tài)指標的相關性較其他形態(tài)指標的相關性小，所以本研究選擇矢量夾角最小、相關性最強的蟲癭厚與幼蟲體長來分別代表蟲癭與幼蟲進行一元線性擬合。

DCA排序圖的對角線基本反映了蟲癭和幼蟲形態(tài)特征的變化規(guī)律，即調查時期由春季向秋季轉變的過程，同時反映了柳厚壁葉蜂蟲癭內幼蟲的生長發(fā)育過程。蟲癭壁厚和幼蟲體寬兩個指標距離其他形態(tài)指標較遠，即這兩個形態(tài)指標與其他指標的相關性較差，這與PCA的研究結果一致。由于納入分析的數據包括蟲癭形態(tài)和幼蟲形態(tài)兩類，所以在進行不同組別數據之間的DCA分析時，排序軸存在明顯差別。

A: 線性回歸分析；B: 條件線性回歸分析。A: Linear regression analysis；B: Conditional linear regression analysis.圖5 柳厚壁葉蜂蟲癭厚與幼蟲體長的線性回歸和條件線性回歸分析Fig.5 Linear regression and conditional linear regression analysis between gall thick and larva length of P. dolichura

主成分分析及DCA分析結果中，不同調查時期柳厚壁葉蜂蟲癭及幼蟲均有較為明顯的界限與分布范圍。蟲癭及幼蟲的8個形態(tài)指標在不同調查時期明顯聚為3類，反映出柳厚壁葉蜂蟲癭及幼蟲各形態(tài)指標在不同發(fā)育時期呈現一定的規(guī)律性，即4月23日之前，蟲癭及幼蟲皆處于初生狀態(tài)，發(fā)育都比較緩慢，形態(tài)變化較??；4月26日—9月29日，蟲癭與幼蟲皆處于生長階段，發(fā)育平穩(wěn)，體型增長較快，規(guī)律性較強；10月12日之后，幼蟲進入老熟階段，幼蟲各形態(tài)數據突然增大，而蟲癭的形態(tài)數據變化較小，兩類形態(tài)數據的關系從線性轉變?yōu)闂l件線性關系。

致癭昆蟲在蟲癭中以植物組織為食或從植物的篩管中獲取營養(yǎng)[34-35]，為擴大蟲癭內部昆蟲的取食面積，獲取更多營養(yǎng)來供給幼蟲，就必須通過增大蟲癭體積來增大內部表面積。本研究發(fā)現，幼蟲老熟階段前(9月)柳厚壁葉蜂蟲癭的形態(tài)隨著幼蟲的體長、體寬增加不斷增長，且二者的變化趨勢基本一致，可能是由于致癭昆蟲取食或者產卵刺激植物組織導致蟲癭不斷增長[36]，隨著蟲癭內幼蟲的生長，刺激程度不斷積累，蟲癭也會逐漸增厚變大。因此，蟲癭的形態(tài)指標可作為估計害蟲發(fā)育狀態(tài)和預測危害程度的重要依據[37]。當柳厚壁葉蜂幼蟲進入老熟階段初期，由于大齡幼蟲取食量的增加，幼蟲形態(tài)和體積發(fā)生劇變，蟲癭與幼蟲表現出條件線性關系，就二者代表性指標而言，只有當幼蟲體長≤6.90 mm時，蟲癭厚和幼蟲體長才存在線性關系，且這一階段的蟲癭癭室達到最大、癭壁達到最厚，隨著幼蟲進入老熟階段，發(fā)育至不食不動狀態(tài)，蟲癭的增長速度減緩甚至停止，最后隨著幼蟲離開蟲癭而略皺縮[7]。

關于致癭昆蟲與蟲癭之間的互作機制， Hapai等[38]和陳湖等[39]認為，致癭昆蟲通過取食蟲癭中特殊營養(yǎng)層細胞來維持生存，而營養(yǎng)層細胞又會不斷進行增殖分化供給蟲體生長所需的營養(yǎng)，蟲癭大小和質量的增加可能與營養(yǎng)層細胞愈傷組織的增生有關。外在影響因素如蟲癭密度、分布范圍以及所在氣候環(huán)境，內在影響因素如致癭昆蟲釋放刺激物的時間、種類、數量等都可能是造成蟲癭在幼蟲老熟階段前不斷生長的原因，具體機制仍將是后續(xù)研究的重點。

致謝：誠摯感謝山西農業(yè)大學南宏偉副教授、禹飛講師和田成講師對數據分析提出寶貴建議。