詹建立，易霞

（1.喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.九江學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332005）

耐鹽細(xì)菌（B.halodurans）是指對(duì)2.5 mol/L 以上濃度氯化鈉有特殊適應(yīng)能力的細(xì)菌.它主要生活在鹽湖、鹽堿湖、海水、廢水、鹽堿地、活性污泥、腌制食品中.由于長(zhǎng)期生活在極端環(huán)境下，菌體細(xì)胞內(nèi)形成多種具有特殊功能的酶以適應(yīng)環(huán)境，進(jìn)而在物種、基因和生理代謝等方面存在多樣性.

國(guó)外對(duì)耐鹽菌的研究起步較早.Arreola R[1]等對(duì)耐鹽芽孢桿菌的轉(zhuǎn)錄因子PyrR 進(jìn)行了初步研究；Anbu Rajan L[2]等對(duì)四氫嘧啶的生物合成基因的進(jìn)化關(guān)系和異源表達(dá)進(jìn)行了研究；楊重[3]等從基因?qū)用鎸?duì)2種耐鉻鹽還原菌Staphylococcus sp.YZ-1 和Bacillus cereusCC-1 的Cr（Ⅵ）脫毒特性與機(jī)理差異進(jìn)行了研究；曹凱[4]等對(duì)浙江舟山鹽場(chǎng)來(lái)源的耐鹽菌（Bacillussp.CK-1）蛋白酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示該菌分泌的蛋白酶活性隨著NaCl 濃度的變化呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).本文主要對(duì)B.haloduransC-125，MIR32，DSM497，XJU-1，XJU-80 等亞種在物種進(jìn)化、代謝生理、遺傳和生物多樣性等方面進(jìn)行歸納，并分析該屬種存在種間多樣性的可能原因.

耐鹽菌研究主要集中在菌株的分離鑒定、功能菌株的開發(fā)利用、酶學(xué)、有機(jī)物的降解和去除、發(fā)酵性能、植物促生特性、有毒物質(zhì)的脫毒機(jī)理等領(lǐng)域.耐鹽菌作為極端微生物，在細(xì)胞內(nèi)形成多種具有特殊功能的酶以適應(yīng)環(huán)境.因此，酶資源的研究和開發(fā)一直是該菌株研究的熱點(diǎn).Nquyen T T[5]等探討了耐鹽芽孢桿菌Bh0493 的催化功能；耐鹽芽孢桿菌C-125 的Bh0225 的一種未知功能的酶編碼基因已經(jīng)成功克隆.Hong Y H[6]等對(duì)耐鹽芽孢桿菌AI 品系依賴于金屬的超嗜熱的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶進(jìn)行了同源重組.Agarwal R[7]等還對(duì)L-核酮糖激酶的底物多樣性進(jìn)行了初步思考.木聚糖酶、漆酶和角蛋白酶的研究也有開展[8-10].當(dāng)然，耐鹽芽孢桿菌的耐鹽機(jī)制仍需深入探討.

2 耐鹽細(xì)菌研究進(jìn)展

我國(guó)學(xué)者在功能菌株的開發(fā)利用方面也有大量研究.閆紅梅[11]從環(huán)氧樹脂廢水中分離得到產(chǎn)堿菌、假單胞菌、芽孢桿菌3 株耐鹽菌株，對(duì)其降解特性進(jìn)行了研究；宋郭柳[12]等利用菌株分離、電鏡觀察和DNA擴(kuò)增技術(shù)從深圳填海區(qū)植物根際土壤中篩選鑒定了3 株耐鹽菌，并對(duì)其碳利用能力進(jìn)行了分析；陳遠(yuǎn)哲[13]等研究了金華火腿來(lái)源的耐鹽菌（Staphylococcus equorum）發(fā)酵對(duì)咸鴨蛋蛋清脫鹽及抗氧化活性的影響；孫曉瑩[14]等對(duì)鹽堿地植物根際土壤來(lái)源的耐鹽菌（Pseudomonas brassicacearumYZX4）的植物促生特性進(jìn)行了研究；陳弘昊[15]等對(duì)3 株耐鹽細(xì)菌（S1Microbacterium sp，G12Zhihengliuella sp，Y3Pseudomon putida）對(duì)多環(huán)芳烴降解性能進(jìn)行了研究.

2.1 菌株分離鑒定

迄今為止，已分離鑒定的B.halodurans有很多，典型種如B.haloduransC-125（JCM9153，AB002661），MIR32（AY017348），DSM8718（X76442），DSM497（AJ302709），AH-101（JCM9161，AB027713），XJU-1（CGMCC 1.4010，AY856453），XJU-80（CGMCC 1.4011，AY856452）等.B.haloduransC-125 分離于1977年[16]，Horikoshi 先后報(bào)道了其分泌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶和木聚糖酶[17-18].B.haloduransC-125（JCM9153，AB002661）是繼B.subtilis之后的又一株全基因測(cè)序的Bacillus，目前已經(jīng)推測(cè)其有4 066 個(gè)編碼蛋白.MIR32（AY017348）于1995 年由Breccia 分離于阿根廷[19].2002 年，M Alejandra Martinez[20]等通過16S rRNA 序列分析、16S-23S rRNA PCR 指紋、tDNA 間區(qū)分析和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將MIR32 鑒定為B.halodurans.DSM8718于1993 年分離于德國(guó)，于1994 年初步將其鑒定為B.halodurans[21].AH-101（JCM9161，AB027713）由Takami 于1989 年分離于日本，最初將其鑒定為能夠產(chǎn)耐熱角蛋白酶的芽孢桿菌（Bacillus）[22].1999 年Takami等又進(jìn)一步將AH-101 鑒定為B.halodurans[23].DSM497（AJ302709）于2000 年由Swiderski 分離于德國(guó).B.haloduransXJU-1 和B.haloduransXJU-80 是國(guó)內(nèi)報(bào)道的又一株耐鹽芽孢桿菌[24]，與南美（阿根廷）、亞洲（日本）和歐洲（俄羅斯）等地分離到的B.halodurans種進(jìn)行了研究.B.haloduransAlk36 是一株嗜堿（pH7.5）耐熱的G+細(xì)菌，其嘌呤核苷磷酸化酶也得以克隆和純化[25-26].這些研究對(duì)闡明B.halodurans屬內(nèi)種的遺傳多樣性具有重要意義.

2.2 多樣性研究

2.2.1 物種多樣性B.haloduran有很多亞種，如C-125，MIR32，AH-101，DSM497，DSM8718，ALK36.這些種在地理分布上存在差異.XJU-1 和XJU-80 同是分離于中國(guó)吐魯番水泥廠的污水中，但是基于16S rRNA序列分析不在同一分支上，前者與分離于日本的C-125 在同一分支上，后者與分離于德國(guó)的DSM497在同一分支上.同時(shí)是分離自日本的C-125 和AH-101 不在同一分支上，同是分離于德國(guó)DSM8718和DSM497也不在同一分支上.可以推斷同屬一物種即便是在同一自然環(huán)境下，也可以演化為不同的亞種.相同因素脅迫下，微生物的進(jìn)化也是多樣性的（見圖1）.

2.2.2 生理代謝多樣性B.haloduransC-125，MIR32，AH-101，XJU-80，XJU-1 在形態(tài)和生理生化方面表現(xiàn)出屬內(nèi)的諸多共性，如G+、棒狀細(xì)胞、孢子大多橢圓且多膨脹、好氧生長(zhǎng)、水解淀粉、液化凝膠.但是這些菌株在表型上呈現(xiàn)出生理和代謝的多樣性（見表1）.如細(xì)胞大小不一，孢子形狀和膨脹部分不同（如卵形和輕微膨脹），生長(zhǎng)的溫度和pH 范圍有差異，NaCl 耐受程度不同，吐溫降解有差異.這些生理和代謝的多樣性很可能源于菌種生活環(huán)境的不同.因?yàn)椴煌瞽h(huán)境給微生物細(xì)胞的脅迫不同，為了適應(yīng)環(huán)境，同一種的細(xì)胞可能會(huì)進(jìn)行不同的代謝，進(jìn)而有了不同的產(chǎn)物.

圖1 B.halodurans 菌株進(jìn)化樹

表1 B.halodurans 菌株的形態(tài)和生理生化特征

2.2.3 基因多樣性（1）16S rRNA 序列.16S rRNA 基因的很多特點(diǎn)有利于進(jìn)行生物進(jìn)化和系統(tǒng)分類研究，如其普遍存在于原核生物細(xì)胞，信息恒定，含量較高且易提取，分子量適中.因此，在B.haloduran種的分類也采用16S rRNA 基因.圖1 說(shuō)明B.haloduran種內(nèi)各菌株間分子進(jìn)化關(guān)系的同時(shí)，也存在16S rRNA序列的多樣性.分離于新疆吐魯番的菌株XJU-1 和XJU-80 在進(jìn)化上并不在同一分支上，而與分離自日本的C-125 和分離自德國(guó)的DSM497處于同一分支上，這說(shuō)明相同生境下的菌株存在基因序列的多樣性.

（2）CG 含量分析（見表2）.CG 含量是目前發(fā)現(xiàn)微生物新種所必需的指標(biāo)之一.B.haloduransCG含量的平均值為43.7%，44.5%，44.1%，42.2%，40.5%，43%.所選6 種菌株（C-125，AH-101），DSM497，（XJU-1，XJU-80），MIR32 分別分離于日本、德國(guó)、中國(guó)，阿根廷，在地理環(huán)境上有顯著的差異，在物種進(jìn)化和遺傳多樣性方面也有代表性.部分B.halodurans菌株的CG 含量不在此范圍，如DSM49（744.5 mol%）和XJU-80（40.5 mol%）.這就體現(xiàn)出B.halodurans在種上的多樣性.據(jù)測(cè)定CG 比相差低于2%時(shí)，沒有分類學(xué)上的意義；種內(nèi)各菌株間的（C+C）mol%含量差別可在2.5%～4.0%之間，若相差在5%以上時(shí)，就可以認(rèn)為屬于不同種，假如差距超過10%，一般就認(rèn)為是不同屬.

表2 B.halodurans 菌株16S rRNA 和CG 含量

（3）DNA-DNA 同源性雜交（見表3）.物種DNA 堿基的排列順序是長(zhǎng)期進(jìn)化的歷史在分子水平上的紀(jì)錄，DNA-DNA 同源性雜交是更精確的遺傳性狀指標(biāo).親緣關(guān)系越近的微生物，其堿基序列也越接近，反之亦然.一般認(rèn)為，若兩菌間CG 比相差1%，則堿基序列的共同區(qū)域就約減少9%；若CG 比相差10%以上，則兩者的共同序列就極少[12]62-67.若有一群CG 比范圍在5%以內(nèi)的菌株，要鑒定它們是否屬同一個(gè)物種，就必須通過DNA-DNA 間的分子雜交.

表3 B.halodurans 菌株DNA-DNA 同源性雜交

由表2 和表3 可見，CG 比范圍在5%以內(nèi)的C-125，XJU-1，XJU-80，DSM497菌株，在DNA-DNA 同源性雜交結(jié)果上顯示明顯的差異性.

3 討論

3.1 多方面綜合考慮微生物譜系分析

在生態(tài)環(huán)境中，由于環(huán)境因子的組成和影響條件不同，各個(gè)生境中的微生物類群的分布和組成就有所不同，B.halodurans物種的多樣性印證了這一點(diǎn).即便是在相同的生境中，同一物種下不同亞種的16S rRNA序列分析也會(huì)有很大的差異，如XJU-1，XJU-80 同是分離于中國(guó)吐魯番水泥廠的污水中，16S rRNA 序列分析卻不在同一分支上.因此，對(duì)微生物的譜系分析應(yīng)該從基因遺傳、生理和生態(tài)等各方面綜合考慮.

3.2 基因改變背景下的環(huán)境脅迫是種間多樣性的原因

B.halodurans種內(nèi)，不同亞種在形態(tài)和生理生化方面表現(xiàn)出諸多共同特征，列舉的幾種B.halodurans亞種在革蘭氏反應(yīng)、細(xì)胞形狀、好氧生長(zhǎng)、生長(zhǎng)溫度、水解淀粉、凝膠液化、乙酸利用、氧化酶、木聚糖方面差異很?。ㄒ姳?）.說(shuō)明這幾種微生物在細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、對(duì)溫度的適應(yīng)、代謝類型、次生產(chǎn)物等方面有共性，它們可能存在乙醛酸途徑來(lái)獲取能量和營(yíng)養(yǎng).因此，環(huán)境脅迫對(duì)于生理代謝的影響和基因相比顯得更為直接，但遺傳基因改變才是環(huán)境影響的背景因素，也是種間多樣性的可能原因.

4 展望

作為極端微生物，耐鹽菌研究主要集中在菌株的分離鑒定，功能菌株的開發(fā)利用、酶學(xué)、有機(jī)物的降解和去除、發(fā)酵性能、植物促生特性、有毒物質(zhì)的脫毒機(jī)理等方面.利用極端環(huán)境脅迫下耐鹽菌不同亞種在形態(tài)和生理生化方面表現(xiàn)出來(lái)的特性，進(jìn)行功能菌株的篩選、改良，并建立功能菌株庫(kù)，這應(yīng)該是耐鹽菌今后研究的主要趨勢(shì).隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，環(huán)境保護(hù)也愈顯迫切.因此，能夠分解有機(jī)物、凈化污水的功能菌株應(yīng)用會(huì)更加廣泛.