楊江濤， 王旭靜， 哈斯阿古拉， 王志興

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081；2.內(nèi)蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010021)

棉花是重要的經(jīng)濟作物，不僅是重要的油料和纖維作物，也是紡織制造業(yè)的優(yōu)選原料，并且還是重要的戰(zhàn)略儲備物資。由于其具有較強的抗旱耐鹽能力，也是缺水地區(qū)和鹽堿地區(qū)的優(yōu)選種植作物之一[1]。隨著物質生活和消費水平的日益提高，人們對棉紡織品的質量要求和需求也越來越高[2]，高新紡紗制造業(yè)對原棉的品質也提出了更高的要求。因此，培育高品質棉花纖維新品種已經(jīng)成為目前棉花育種工作的首要目標之一。

由于棉花生長周期長、種質間相互利用困難、纖維產(chǎn)量與品質呈負相關關系等因素的制約，采用常規(guī)雜交育種方法很難在短期內(nèi)培育出纖維品質優(yōu)良的棉花新品種。轉基因技術的發(fā)展和應用為棉花纖維品質的改良提供了一條新的途徑[3]。它能夠克服物種間遠緣雜交不親和的障礙，將其他物種中具有優(yōu)良性狀的基因克隆到棉花基因組中，從而提高棉花各方面的抗性和纖維的品質。研究人員經(jīng)過20多年的努力，克隆出了許多直接參與棉纖維合成和調(diào)控纖維伸長發(fā)育相關的基因及其啟動子，例如，海島棉纖維優(yōu)勢表達FbL2A基因及其啟動子[4]、陸地棉編碼β-微管蛋白纖維優(yōu)勢表達GhTUB1基因及其啟動子[5]、在棉纖維發(fā)育全過程中特異表達的FSltp4基因啟動子[6]、纖維伸長期優(yōu)勢表達GhCPK1基因及其啟動子[7]、調(diào)控纖維發(fā)育的纖維特異表達GhPRP5基因及其啟動子[8]、棉纖維特異表達的CFSP基因啟動子[9]、陸地棉纖維優(yōu)勢表達基因GhRACK1的啟動子[3]、海島棉纖維特異表達GbEXPA2基因及其啟動子[10]以及棉絨纖維發(fā)育相關的調(diào)控基因MIXTA[11]等。上述基因為培育優(yōu)良纖維品質的棉花新種質提供了扎實的理論基礎。

Uhrf1編碼具有RING結構域的E3泛素蛋白連接酶，其參與調(diào)節(jié)植物分生組織中細胞的分裂分化和增殖過程。例如，擬南芥PUB4可以調(diào)節(jié)根部分生組織中細胞的不對稱分裂和細胞增殖，進而促進根的生長發(fā)育[12]；水稻TUD1與異三聚體Ga亞基相互作用共同調(diào)節(jié)水稻中的油菜素類固醇(BR)信號傳導途徑，從而介導水稻的生長發(fā)育[13]；煙草PUB4是與CHRK1受體類激酶相互作用的配偶體，并且可能參與調(diào)節(jié)由CHRK1介導的植物絨毯層細胞分化生長和降解途徑[14]。棉纖維是單個胚珠外珠被表皮細胞經(jīng)過特殊化的起始分化、伸長、增厚和脫水，最終形成成熟表皮纖維[15]。棉花纖維原始細胞的分化起始是一個極其復雜的代謝過程，依賴多種物質信號進行多層次多途徑的精確網(wǎng)絡調(diào)控，并且棉花胚珠外珠被表皮細胞突起的多少決定最終成熟纖維的數(shù)量，而分化起始的早晚決定纖維長短絨的類型[16]。因此，推測Uhrf1在棉纖維原始細胞分化起始過程中發(fā)揮著重要作用。

開發(fā)纖維特異啟動子或種皮發(fā)育特異啟動子是我國棉花優(yōu)質纖維新品種研究的主要目標之一。本研究通過對棉花根葉混合和纖維兩個轉錄組測序數(shù)據(jù)進行差異基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)Ghuhrf1基因屬于纖維細胞分化起始期優(yōu)勢表達基因。基于陸地棉TM-1基因組數(shù)據(jù)庫信息，克隆了Ghuhrf1基因的5’上游啟動子Ghuhrf1-Pro序列，構建不同長度缺失體分析了啟動子序列中的重要順式作用元件，以期為Ghuhrf1基因的功能研究奠定基礎，并為棉花纖維品質改良基因工程提供新的基因資源和調(diào)控元件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試材料 陸地棉(Gossypiumhirsutum)蘇棉12、本氏煙草(Nicotianabenthamiana)和野生型擬南芥(Col0)種子由本實驗室保存，大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)購自北京康為世紀生物科技有限公司；pMD18-T載體購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司，農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達載體pCambia 1305.1由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑 常規(guī)質粒提取和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購于NEB公司；高保真DNA聚合酶購于南京諾唯贊生物科技有限公司；RACE試劑盒(The GeneRacerTMRNA Oligo)購自Thermo Fisher Scientific公司；其他生化試劑均為分析純，購自北京拜爾迪生物技術有限公司?；驕y序和引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1Ghuhrf1基因全長cDNA的克隆 參考The GeneRacerTMRNA Oligo試劑盒說明書，首先對纖維mRNA進行脫磷、脫帽處理，然后再以Oligo dT為引物進行反轉錄，最后以GeneRacer 5’Primer/Ghuhrf1-5’GSP1和GeneRacer 5’Nested Primer/Ghuhrf1-5’GSP2為引物(表1)，通過兩次PCR從棉纖維cDNA中擴增得到Ghuhrf1的5’末端產(chǎn)物。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。同理，以GeneRacer 3’Primer/Ghuhrf1-3’GSP1和GeneRacer 3’Nested Primer/Ghuhrf1-3’GSP2為引物(表1)，進行兩輪PCR得到3’末端產(chǎn)物，PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 8 min。將得到的產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，組裝后獲得Ghuhrf1的全長cDNA。

表1 本研究所用的引物

1.2.2Ghuhrf1基因熒光定量PCR 提取蘇棉12的根、葉片、花藥、柱頭和0、5、7、14、21、26 和28 DPA(days post anthesis)纖維的總RNA，并反轉錄成cDNA。以q-sad-F/q-sad-R為內(nèi)參基因引物，以q-Ghuhrf1-F/q-Ghuhrf1-R為目標基因引物，進行熒光定量PCR分析，具體操作步驟參照ABI7500熒光定量PCR操作手冊。

1.2.3Ghuhrf1基因啟動子的克隆 將Ghuhrf1基因序列與中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所CGP(cotton genome project)數(shù)據(jù)庫中陸地棉TM-1基因組進行同源比對。參照其基因組信息，設計引物(Ghuhrf1P-F和Ghuhrf1P-R)(表1)，以14 DPA纖維的基因組DNA為模板，通過PCR技術擴增Ghuhrf1基因5’上游序列。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴增的目的條帶與pMD18-T載體連接后轉化大腸桿菌，挑選陽性克隆進行測序。

1.2.4Ghuhrf1-Pro缺失體的克隆與植物表達載體構建 根據(jù)Ghuhrf1-Pro序列設計引物(表1)，在下游和上游引物的5’端分別添加了NcoⅠ和XbaⅠ酶切位點。以Ghuhrf1-Pro質粒為模板，分別以R/F-1417、R/F-1180、R/F-867、R/F-726和R/F-328為引物進行PCR擴增。PCR反應體系(30 μL)：2×Phanata Max Buffer 15 μL，dNTP Mix 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，Phanata Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 10.4 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃或52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。獲得的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉化大腸桿菌，挑選陽性克隆并測序鑒定。選擇pCamBIA1305.1質粒作為植物表達載體骨架，雙酶切構建植物表達載體，并分別命名為pGhuhrf1-Pro、pGhuhrf1-Pro1、pGhuhrf1-Pro2、pGhuhrf1-Pro3和pGhuhrf1-Pro4。

1.2.5農(nóng)桿菌介導法轉化本式煙和擬南芥 利用熱擊法[17]將植物表達載體轉入農(nóng)桿菌LBA4404，培養(yǎng)在YEB液體培養(yǎng)基(250 mg·L-1鏈霉素、250 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素)中。收集菌體并用液體MS基本培養(yǎng)基重懸稀釋至OD600為0.4左右。首先，侵染本氏煙草葉片進行瞬時表達實驗[18]：在本氏煙植株6～8片真葉期，選取距離頂部最近的嫩葉，用1 mL的微量針管進行葉下表皮注射，最少注射整個葉片的2/3，高濕度黑暗條件下培養(yǎng)16 h，然后正常培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗)2 d，將葉片取下進行GUS組織化學染色。其次，利用花絮浸染法將植物表達載體轉化擬南芥進行穩(wěn)定表達實驗[19]：挑選花期正旺的擬南芥植株，剪掉授完粉和長出角果的部分，將花序浸沒在含有0.03% silwet L-77的重懸菌液中，靜置5 min后置于23 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h后正常培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗)。將獲得的T0代種子在含有 50 mg·L-1潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上篩選陽性轉化體。

1.2.6轉基因擬南芥PCR檢測 提取轉基因擬南芥基因組DNA，利用對應的引物進行PCR擴增，反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.7GUS組織化學染色 參考Jefferson等[20]的方法，將待染色葉片浸入X-gluc溶液中，用parafilm封口膜封口，37 ℃避光放置12 h，鏡檢前，用FAA固定液浸泡15 min，之后依次用75%乙醇溶液、85%乙醇溶液、95%乙醇溶液和100%乙醇脫色，去除色素，然后進行顯微鏡觀察，白色背景下的藍色即為GUS表達位點。

2 結果與分析

2.1 Ghuhrf1基因全長cDNA的分析

通過分析棉花根葉混合和纖維兩個轉錄組測序數(shù)據(jù)，獲得開花當天差異表達的EST序列并設計引物，通過5’RACE和3’RACE方法分別擴增出503 bp和586 bp的條帶。與EST序列進行拼接后，獲得基因全長cDNA為2 278 bp，其中5’UTR長226 bp，3’UTR為201 bp，CDS長度為 1 851 bp，編碼616個氨基酸，分子量為68.3kD，等電點為6.60。Blastn比對結果表明，獲得的Ghuhrf1基因與已知的uhrf1基因同源性較高，與亞洲棉和可可中的uhrf1基因的核苷酸序列相似性分別為99%和88%。通過NCBI在線網(wǎng)站中的CDD對推測蛋白進行保守結構域預測，發(fā)現(xiàn)位于16～61、133～171和461～523 aa之間存在RING結構域，編碼產(chǎn)物為E3 泛素連接酶，其主要是充當“橋接因子”，將復合體蛋白-E2與泛素底物連接來促進泛素轉移，從而影響植物體中蛋白質的豐度和蛋白質的活性。

蛋白同源性分析結果表明，推導的蛋白與E3泛素蛋白連接酶蛋白家族中的UHRF1蛋白具有很高的相似性，與亞洲棉中的UHRF1蛋白同源性最高，親緣關系最近，相似性可達98%；其次為可可和榴蓮，相似性為87%；與其他已知的UHRF1蛋白的相似性也都在70%以上，如與黃麻、柚子、木薯和蓖麻(圖1)。由此推測克隆到的基因為E3泛素蛋白連接酶UHRF1家族，將其命名為Ghuhrf1.

圖1 GhUHRF1蛋白的同源進化樹

2.2 Ghuhrf1的組織表達特異性分析

從圖2可以看出，Ghuhrf1基因在開花當天的胚珠中表達量最高，是根、葉和柱頭表達量的4倍左右，而在纖維其他發(fā)育時期中只有微量的表達。因此，推測Ghuhrf1基因直接參與棉纖維的合成或間接的調(diào)控棉纖維原始細胞的分化起始。

注：*和**分別表示差異與根中相比在P<0.05和P<0.01水平具有統(tǒng)計學意義。

2.3 Ghuhrf1啟動子的克隆及序列分析

將Ghuhrf1基因序列與CGP數(shù)據(jù)庫中的陸地棉TM-1基因組進行比對，發(fā)現(xiàn)Ghuhrf1基因序列位于D基因組的第6染色體上?；陉懙孛藁蚪M信息，從蘇棉12基因組DNA中擴增得到Ghuhrf1基因5’上游序列。經(jīng)過測序，去除與基因重疊和5’UTR的序列，共獲得1 417 bp的5’上游序列。

利用PlantCARE和PLACE軟件在線分析Ghuhrf1啟動子序列中的順式作用元件。發(fā)現(xiàn)該序列中除了含有GC-box、CAAT-box、Inr等啟動子基本核心元件外，還含有與分生組織表達相關的CAT-box元件和CCGTCC-box元件、與種子特異表達有關的ACGT-motif元件和AACA-motif元件、與花器官特異表達的Skn-1 motif元件、與胚乳特異基因的表達有關AACACOREOSGLUB1元件、與葉特異表達相關的INRNTPSADB元件和AT-1 box元件等(表2)。

表2 Ghuhrf1啟動子序列中順式元件分析

2.4 Ghuhrf1啟動子缺失體分析

根據(jù)Ghuhrf1啟動子序列上順式作用元件的位置分布情況，對Ghuhrf1啟動子進行了不同長度的缺失，利用PCR方法克隆得到了Pro1(-1 180～+226 bp)、Pro2(-867～+226 bp)、Pro3(-726～+226 bp)和Pro4(-328～+226 bp)四個缺失體。相對于Ghuhrf1全長啟動子Pro(-1 417～+226 bp)來說，Pro1缺失了與種子特異表達有關的ACGT-motif元件；Pro2缺失了與種子特異表達有關的AACA-motif元件和與葉的特定表達相關的AT-1 box元件；Pro3缺失了與分生組織表達相關的CAT-box和CCGTCC-box元件；Pro4缺失了所有的與分生組織表達和器官組織特異表達相關的調(diào)控元件，只含有GC-box、CAAT-box和Inr等啟動子核心調(diào)控元件(圖3)。

圖3 Ghuhrf1-Pro缺失體結構

以pCAMBIA1305.1為載體骨架，以Gus基因為報告基因，分別構建了全長啟動子Ghuhrf1-Pro和4個啟動子缺失體的植物表達載體用于驅動活性分析。

2.5 煙草瞬時結果表達分析

將構建好的植物表達載體轉化本氏煙草，3 d后進行組織化學染色(圖4)。轉經(jīng)過組織化學染色和脫色后，空載體農(nóng)桿菌的葉片呈現(xiàn)無色，說明沒有背景污染；注射含有35S啟動子的pCamBIA1305.1農(nóng)桿菌的葉片呈現(xiàn)藍色，說明Gus基因可以進行正確表達；轉Ghuhrf1-Pro和4個缺失體的葉片經(jīng)過組織化學染色和脫色后，呈現(xiàn)藍色，說明Ghuhrf1-Pro和4個缺失序列都能夠啟動Gus基因的表達。因此，可以進一步用于分析該啟動子中順式作用元件的主要功能。

圖4 不同Ghuhrf1缺失體驅動Gus基因在煙草葉片中的瞬時表達

2.6 不同缺失體驅動活性分析

分別取不同缺失體轉基因擬南芥進行GUS組織化學分析(圖5)。染色結果表明，含有全長啟動子Pro的轉基因擬南芥只能在生長分化比較旺盛的部位檢測到GUS蛋白活性，例如葉邊緣尖部、蓮座葉基部和未成熟角果頂端。缺失體Pro1的轉基因擬南芥，Gus基因在葉邊緣尖部和蓮座葉基部中的表達模式與全長啟動子基本一致，但是在未成熟角果頂端部位表達量有所降低，說明ACGT-motif元件能增強啟動子在種子器官中的活性。缺失體Pro2的轉基因擬南芥葉邊緣尖部和蓮座葉基部中，Gus基因的表達水平與全長啟動子相比有所降低，而在未成熟角果頂端部位沒有檢測到Gus基因的表達，說明ACGT-motif和AACA-motif元件的缺失導致Gus基因不能在種子中表達，因此，充分證明了這兩個元件為種子特異表達相關元件。缺失體Pro3的轉基因擬南芥葉邊緣尖部和蓮座葉基部中，Gus基因的表達水平與全長啟動子相比明顯降低，并且在未成熟角果頂端部位也沒有檢測到GUS蛋白活性，說明CCGTCC-box元件能增強啟動子在分裂分化旺盛部位中的活性。然而，在只含有啟動子基本作用元件的缺失體Pro4轉基因擬南芥中，Gus基因的表達呈現(xiàn)組成型表達，在整株植物體各個組織中都有表達，但是GUS蛋白的表達量均沒有CaMV 35S啟動子的高，表明CAT-box元件和CCGTCC-box元件為分生組織特異表達元件。上述分析進一步證明ACGT-motif和AACA-motif元件為種子特異表達相關元件，CAT-box元件和CCGTCC-box元件為分生組織表達相關元件。由于棉花纖維是由單個胚珠外珠被表皮細胞經(jīng)過特殊化的分化起始、伸長、增厚和脫水成熟過程而最終形成種子表皮纖維，因此，推測全長啟動子上的這些元件與種子發(fā)育和細胞生長分化時期密切相關，可能是其在棉花纖維細胞原始細胞分化起始過程中所必需的。

圖5 不同Ghuhrf1缺失體驅動Gus基因在擬南芥中的穩(wěn)定表達

3 討論

棉花纖維是由單個胚珠表皮細胞經(jīng)過多次分化和發(fā)育等一系列復雜的過程而形成的種子纖維，根據(jù)棉纖維發(fā)育過程中表現(xiàn)的各種不同特征，研究人員將其劃分為4個發(fā)育階段：原始纖維細胞的分化起始階段、纖維細胞伸長階段、次生壁加厚階段和脫水成熟階段。在棉纖維原始細胞分化起始期，胚珠表皮上接近30%的纖維原始細胞進行分化形成纖維細胞，最終形成成熟的纖維[21]。因此，該時期直接決定了棉花成熟纖維的數(shù)量。本研究利用差異基因表達譜分析技術篩選到一條纖維原始細胞分化起始期優(yōu)勢表達基因Ghuhrf1，該基因在開花當天(0 DPA)的胚珠中表達量最高，在纖維其他時期中只有微量的表達，然而開花當天正是棉纖維原始細胞分化開始階段，復雜的調(diào)控途徑調(diào)控著纖維原始細胞分化的起始。許多研究報道具有E3泛素蛋白連接酶基因uhrf1參與調(diào)節(jié)分生組織中細胞的分裂分化和細胞增殖過程[22-23]。因此，推測Ghuhrf1基因主要參與棉纖維的合成或者參與對棉纖維原始細胞分化起始的調(diào)控。

纖維特異啟動子能夠驅動外源優(yōu)良基因只在纖維中進行表達，相比于組成型啟動子，它能夠實現(xiàn)外源基因的定時定點表達，同時還能夠避免棉花體內(nèi)代謝產(chǎn)物的浪費。組織特異性啟動子除了具有核心啟動子所必需的順式作用元件(CAAT-box，TATA-box等)外，還存在一些調(diào)控基因在組織中特異表達的作用元件，如CAT-box元件和CCGTCC-box元件為分生組織特異表達的調(diào)控元件[24]，RHEs為根毛特異表達的調(diào)控元件[25-26]，AACA-motif、AT-1 box、ACGT和GATA等順式作用元件為決定組織特異表達相關轉錄因子的結合位點[27]等。根據(jù)重要調(diào)控元件在啟動子序列上的位置分布情況，有目的性的從啟動子5’端上游序列對啟動子進行不同程度的缺失，通過轉基因植物中報告基因的表達情況可推斷調(diào)控元件的主要功能[28-29]。本研究參考陸地棉TM-1基因組信息，克隆了Ghuhrf1基因5’上游序列，該啟動子除了含有GC-box、CAAT-box和Inr等核心啟動子所必需的順式作用元件外，還含有一些與器官組織特異表達相關的調(diào)控元件，例如，CAT-box元件、CCGTCC-box元件、AT-1 box元件、AACA-motif元件、ACGT-motif元件等。通過比較不同缺失體中Gus基因的表達情況，證明CAT-box元件和CCGTCC-box元件是分生組織表達所必需的調(diào)控元件，并且這些調(diào)控元件的數(shù)量決定著啟動子活性的強弱。研究表明,棉纖維的生長發(fā)育機制與煙草和擬南芥的根毛及表皮毛的生長發(fā)育機制具有相似性[30-33]。然而，在全長啟動子Ghuhrf1-Pro和4個缺失體Pro1、Pro2、Pro3的轉基因擬南芥的根毛及表皮毛中都沒有檢測到Gus基因的表達。因此，推測Ghuhrf1基因可能不直接參與棉纖維的合成，而是間接的參與棉纖維原始細胞分化起始的調(diào)控。但是，Ghuhrf1基因參與哪些代謝調(diào)控和調(diào)控哪些基因等一系列重要問題，這些問題的解決方案仍有待進一步證實。