陳曉, 石巍

(中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所, 北京 100093)

我國是養(yǎng)蜂大國，蜂產(chǎn)品產(chǎn)量居世界前列。同時，蜜蜂也是維持生態(tài)環(huán)境持續(xù)發(fā)展不可或缺的物種，是植物、特別是新興設施作物的主要授粉昆蟲。蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)的關鍵是種蜂王，其優(yōu)劣直接影響?zhàn)B蜂經(jīng)濟效益。繁殖性狀是蜂王直接展現(xiàn)出的重要經(jīng)濟性狀，同時也是蜂群產(chǎn)生經(jīng)濟效益的重要基礎性狀。因此，研究蜂王繁殖性狀的遺傳和調(diào)控機制是蜜蜂遺傳育種領域的重要課題。

蜜蜂繁殖性狀RNA的研究對于闡明蜜蜂繁殖性狀的分子遺傳機制意義重大，也為挖掘繁殖性狀分子標記基因、開展分子育種工作，進而提高蜜蜂繁殖性能、增加養(yǎng)蜂經(jīng)濟效益奠定基礎。伴隨著分子生物學的發(fā)展，研究人員對蜂王繁殖性狀分子遺傳機制的研究從單個編碼基因開始，到后來的高通量測序，從未停止過[1-5]。近幾年，研究人員也加強了非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在蜜蜂繁殖活動中作用的研究[6-10]。非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，研究發(fā)現(xiàn)生物體越復雜，非編碼RNA所占的比例就越大，說明非編碼RNA在生命活動中發(fā)揮重要作用[7-8]。在蜜蜂繁殖過程中編碼RNA(coding RNA，cRNA)和非編碼RNA發(fā)揮了重要作用，近幾年,研究人員通過高通量測序的方法獲得了蜜蜂工蜂、處女蜂王和產(chǎn)卵蜂王卵巢和腦部組織的編碼RNA和非編碼RNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)RNA的表達量與蜜蜂卵巢的激活狀態(tài)緊密相關。本文詳細闡述了蜜蜂繁殖性狀相關的編碼RNA和非編碼RNA的研究進展，介紹了信使RNA(messenger RNA，mRNA)、小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)以及近幾年才發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)在蜜蜂卵巢激活、產(chǎn)卵等繁殖性狀中取得的研究進展情況，以期為蜜蜂繁殖性狀的分子遺傳機制研究提供參考。

1 編碼與非編碼RNA

基因組DNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生兩大類RNA，一類是可以被翻譯成蛋白質(zhì)的編碼RNA，即mRNA；另一類是不具有或具有較低編碼能力的非編碼RNA。許多物種的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，基因組中只有很小一部分基因編碼蛋白，例如人類中僅有小于2%的基因組編碼蛋白，因此,轉(zhuǎn)錄組中有很多非編碼RNA序列。非編碼RNA包括普遍存在的轉(zhuǎn)運RNA(transfer RNA， tRNA)、核糖體RNA(ribosome RNA，rRNA)，以及具有組織表達特異性和時間表達特異性的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、miRNA、circRNA、lncRNA等。

2 蜜蜂繁殖性狀相關的編碼RNA及非編碼RNA

2.1 與蜜蜂繁殖性狀相關的mRNA

關于mRNA在蜜蜂繁殖活動中的作用，多集中在保幼激素(juvenile hormones，JH)、蛻皮激素(ecdysteroids，Ec)和卵黃原蛋白(vitellogenin，Vg)上，或者是JH、Ec和Vg的下游基因[1]。JH和Ec是蜜蜂繁殖活動中最重要的激素[1-3]，而Vg是卵黃蛋白的前體，卵黃蛋白是蜜蜂卵的主要成分。

2008年以后，研究人員逐漸開始采用高通量方法研究蜜蜂繁殖相關過程中大規(guī)?；虻谋磉_變化,結(jié)果表明，蜂王在卵巢激活過程中，其腦部和卵巢轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)生了大規(guī)模的改變[4-6]。Kocher等[5]利用基因芯片的方法,比較了相同日齡的處女王、交尾一次但未開始產(chǎn)卵蜂王，以及交尾一次開始產(chǎn)卵蜂王的腦和卵巢的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)有971個轉(zhuǎn)錄本在3組樣本腦部差異表達，366個轉(zhuǎn)錄本在卵巢差異表達。還有研究人員利用基因芯片分析同齡處女王、不育工蜂和產(chǎn)卵工蜂腦部基因的表達，發(fā)現(xiàn)蜂王和不育工蜂約有2 000個基因差異表達，產(chǎn)卵工蜂和不育工蜂有221個基因差異表達，并且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵工蜂基因的表達模式與蜂王更為類似[7]。mRNA表達發(fā)生了顯著變化，說明其在蜜蜂繁殖活動中發(fā)揮重要作用。

根據(jù)前人的研究結(jié)果，對已知與蜜蜂繁殖性狀相關的mRNA進行整理發(fā)現(xiàn)，一些基因與蜜蜂繁殖重要激素Ec及其受體、JH相互作用，從而影響蜜蜂的繁殖過程。例如，多巴胺受體2(dopamine receptor 2,Dopr2)、蛻皮激素受體(ecdysone receptor，Ecr)、蛻皮激素誘導蛋白75(ecdysone-induced protein 75,E75)、蛻皮激素調(diào)節(jié)基因(ecdysteroid-regulated gene E74，E74)、蜂王漿主蛋白3(major royal jelly protein 3,Mrjp3)等基因是Ec的下游基因，參與Ec引導的信號通路。E75、Kruppel 同系物1(Kruppel homolog 1,Kr-h1)和核激素受體Ftz-f1(nuclear hormone receptor Ftz-f1)是JH下游基因，參與JH介導的信號通路。E75連接了蜜蜂繁殖兩大重要激素，Ec和JH的信號能相互協(xié)調(diào)共同作用于蜜蜂的繁殖過程。另外，還有一些基因雖沒有直接參與Ec和JH信號通路，但依然在蜜蜂繁殖活動中發(fā)生了表達水平的顯著變化，例如,細胞色素家族的多個基因，它們在蜜蜂繁殖活動的作用有待進一步挖掘。各mRNA在蜜蜂繁殖過程中潛在的功能作用見表1。

表1 蜜蜂繁殖性狀相關的mRNATable 1 mRNAs related to honey bees reproductive traits

2.2 與蜜蜂繁殖性狀相關的miRNA

miRNA是目前研究最廣泛的非編碼RNA，它是一類長度為19～25 nt的內(nèi)源非編碼RNA，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控活動。其中，多數(shù)miRNA具有高度保守性、表達時序性和組織特異性[13]。2018年3月，Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫(miRBase)中具有發(fā)夾前體序列蜜蜂miRNA 259條，成熟miRNA產(chǎn)物262條，關于蜜蜂miRNA的相關參考文獻報道有1 482條。最新研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂卵巢組織的miRNA長度主要集中在20～23 nt，但是在蜂王和工蜂中又存在差別，蜂王卵巢組織的miRNA長度集中在20～22 nt，工蜂卵巢組織的miRNA長度集中在20～23 nt[13-17]。蜜蜂卵巢組織miRNA在每條染色體都有分布，在蜂王中，1號染色體miRNA分布最多；在工蜂中，15號染色體miRNA分布最多[13-17]。

最近的研究表明，miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，具有重要的基因表達調(diào)控作用[13-14]。目前，研究人員已經(jīng)在蜜蜂中發(fā)現(xiàn)一些與繁殖性狀相關的重要miRNA，例如， Macedo等[10]和Ashby等[15]研究發(fā)現(xiàn),ame-miR-bantam、ame-miR-184和ame-miR-315參與蜜蜂的組織結(jié)構(gòu)重塑、細胞分化、卵巢發(fā)育和級型分化。此外，ame-miR-14和ame-miR-8與JH和Ec密切相關[8,15-16]，而JH和Ec是蜜蜂繁殖活動中最重要的激素[2-3]。以上研究說明，miRNA在蜜蜂繁殖活動中可能發(fā)揮著重要作用。與蜜蜂繁殖性狀相關的miRNA見表2。

表2 蜜蜂繁殖性狀相關的miRNATable 2 miRNAs related to honey bees reproductive traits

2.3 與蜜蜂繁殖性狀相關的lncRNA

lncRNA是另一類重要的非編碼RNA。它是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其表達具有組織特異性和時序性，在細胞分化、發(fā)育、免疫等方面發(fā)揮重要作用[18-20]。蜜蜂卵巢組織的lncRNA長度范圍從96 nt到20 674 nt不等，平均長度約為1 881 nt；lncRNA在每條染色體都有分布，其中在1號染色體分布最多，13號染色體分布最少；>93%的lncRNA包含2～5個外顯子[21]。

2014年,Necsulea等[22]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA具有在動物中卵巢組織表達的偏好性；2015年,Jayakodi等[23]在蜜蜂的卵巢組織中發(fā)現(xiàn)了特異表達的基因間長鏈非編碼RNA；2017年,Chen等[21]通過高通量測序和生物信息學方法鑒定和分析了蜜蜂卵巢組織特異表達的lncRNA。但是關于特定lncRNA在蜜蜂繁殖活動中的作用，還需要相關的分子實驗進行驗證。2011年,Graham等[24]鑒定了蜜蜂卵巢大小相關的QTL區(qū)間，這個QTL區(qū)間位于蜜蜂基因組11號染色體8.9～12.2 Mb，其對鑒定蜜蜂繁殖活動相關RNA具有重要參考價值。物理位置在蜜蜂卵巢大小相關的QTL區(qū)間內(nèi)的，并且在蜜蜂卵巢組織特異表達的lncRNA見表3。

表3 分布在蜜蜂卵巢大小相關的QTL區(qū)間內(nèi)且在蜜蜂卵巢組織特異表達的lncRNA[21]Table 3 lncRNAs located in the QTL region for ovary size in honey bees’ ovary[21]

2.4 與蜜蜂繁殖性狀相關的circRNA

circRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的重要調(diào)控因子，具有組織表達特異性、時序性等特點，能夠吸附miRNA，對基因具有表達調(diào)控作用。circRNA與傳統(tǒng)的線性RNA不同，是特殊非編碼RNA分子，呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶的影響，表達更穩(wěn)定，不易降解[25-28]。2012年,斯坦福大學和霍華德休斯醫(yī)學研究所的科學家首次證實，人體細胞的基因表達時，circRNA分子比線性RNA分子是更普遍的現(xiàn)象[26]。circRNA已成為RNA領域的最新研究熱點[27,29-31]。

蜜蜂卵巢組織circRNA的類型主要包括外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA、反義鏈circRNA、基因間circRNA。其中，外顯子circRNA占80%以上，>57% circRNA包含2～3個外顯子[32]。蜜蜂卵巢組織circRNA在每條染色體上都有分布，其中1號染色體分布最多，有超過2 000個circRNA，其他染色體各分布800～1 500個circRNA[32]。

circRNA的生物學功能主要是根據(jù)其來源基因的功能進行預測，如果circRNA來源于繁殖相關的基因，那么該circRNA在蜜蜂繁殖活動中就可能發(fā)揮關鍵作用。來源于蜜蜂繁殖性狀相關的circRNA見表4。

表4 來源于蜜蜂繁殖性狀相關基因的circRNA[32]Table 4 circRNAs produced by genes with known or suspected roles of in reproductive related processes in honey bees[32]

3 編碼RNA與非編碼RNA之間的相互作用

目前，對編碼RNA與非編碼RNA之間的相互作用研究較多的是miRNA與基因之間的相互作用。miRNA能夠通過與靶基因相結(jié)合，影響基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而影響各種生物過程。在蜜蜂中，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-14在卵巢激活和產(chǎn)卵啟動時表達均顯著下調(diào)[10]；而miR-14與Ecr的表達顯著相關，并且Ecr的基因序列中含有miR-14的序列結(jié)合位點[11]，同時Ecr能夠影響蜜蜂蛻皮激素含量和產(chǎn)卵[16-19]。因此，可以推斷miR-14可能通過序列結(jié)合位點結(jié)合Ecr，通過調(diào)節(jié)Ecr的表達，而影響蜜蜂蛻皮激的素含量，進而影響蜂王產(chǎn)卵。2018年,研究人員對蜜蜂circRNA進行分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA circ_16640含有miR-14序列結(jié)合位點，能夠競爭性地吸附miR-14[32]。研究推測，環(huán)狀RNA circ_16640可能通過序列結(jié)合位點吸附miR-14，解除miR-14對Ecr的抑制作用，進而促進蛻皮激素的合成、促進蜂王的卵巢激活和產(chǎn)卵啟動[32]。3種RNA形成circRNA-miRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡，對生物過程發(fā)揮作用。關于lncRNA與編碼RNA的相互作用，有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA XLOC_073978能夠與Ecr下游基因Obp10相互作用，進而影響蜜蜂繁殖相關過程。更多關于編碼RNA與非編碼RNA之間的相互作用有待進一步的研究。

4 展望

本文綜述了mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA在蜜蜂卵巢激活、產(chǎn)卵等繁殖活動中的作用，這些RNA表達的升高或降低與蜜蜂卵巢激活、產(chǎn)卵調(diào)控等過程密切相關。通過基因標記、調(diào)節(jié)RNA的表達水平等，可實現(xiàn)調(diào)控或影響蜜蜂的繁殖活動。但是目前仍有許多問題亟待解決，例如，如何應用載體增加蜜蜂繁殖組織mRNA和ncRNA的表達，外源性補充的ncRNA與內(nèi)源性ncRNA發(fā)揮作用的方式是否相同，如何針對特異性的細胞調(diào)控mRNA和ncRNA的表達等，這些問題都需要分子生物學實驗探索解決。蜜蜂繁殖組織mRNA和ncRNA的研究對于闡明蜜蜂繁殖性狀的分子遺傳機制意義重大，也為提高蜜蜂繁殖性能、進而提高養(yǎng)蜂經(jīng)濟效益奠定基礎。蜜蜂繁殖性狀相關RNA的研究中，關于mRNA和miRNA對蜜蜂卵巢激活的研究最多，但是關于lncRNA和circRNA在蜜蜂繁殖性狀中的研究才剛剛起步，更多在蜜蜂繁殖活動中發(fā)揮關鍵作用的lncRNA和circRNA亟需被發(fā)掘與研究。不管是編碼RNA還是非編碼RNA，其在蜜蜂繁殖過程中的功能研究都還有很長的路要走。