張小瓊， 邰 勇， 徐東炯

（1． 江蘇省環(huán)境保護(hù)水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室， 江蘇 常州 213001；2．江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 常州 213001；3．江蘇理工學(xué)院， 江蘇 常州 213100）

0 引言

微生物是生態(tài)系統(tǒng)中重要的一環(huán)， 通過對微生物的數(shù)量、代謝活性、群落結(jié)構(gòu)及代謝功能等幾個不同層面進(jìn)行研究， 可以得到微生物群落差異與不同環(huán)境狀況之間的對應(yīng)關(guān)系[1]。 傳統(tǒng)研究方法主要通過分離菌種， 菌種鑒定來分析微生物群落的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，不僅耗時長、工作量大，也無法檢測到環(huán)境中不可培養(yǎng)的微生物。 近年來已開始廣泛采用以微生物醌法和脂肪酸法等基于生物標(biāo)志物的測定方法以及以DGGE，F(xiàn)ISH 等為代表的分子生物學(xué)法[2-3]。 其中，Biolog-ECO 法通過單一碳源的利用程度來表示微生物群體水平， 描述微生物群落的功能多樣性。Biolog-ECO 法通過直接培養(yǎng)環(huán)境樣品，可觀察到環(huán)境中不能人工培養(yǎng)的某些微生物， 相較于分子生物學(xué)方法簡單， 也無需基因組學(xué)等方面的專業(yè)知識[4]。Biolog 方法可通過單孔顏色平均值（AWCD）計算，多樣性指數(shù)計算等統(tǒng)計分析方法來反映關(guān)于環(huán)境中微生物活性的豐富信息[5]。這些信息可用于評估湖泊現(xiàn)狀的富營養(yǎng)化狀況[6]及污染湖泊的修復(fù)[7]。

洮滆水系是太湖的主要來水區(qū)域之一， 其以長蕩湖、滆湖為中心，通過東西流向的漕橋河、太滆運河、 殷村港等多條主干河道匯入太湖竺山湖。 據(jù)測算， 洮滆水系的入湖水量約占太湖上游來水總量的20%左右[5]。長蕩湖、滆湖、太湖竺山湖為該水系中最具代表性的沿上下游排列的3 個湖庫[8]。長蕩湖是太湖流域上游的第三大湖泊， 近年來受周邊工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生活用水影響，水體富營養(yǎng)化有加快趨勢[9]。而近年來由于大規(guī)模的圍網(wǎng)養(yǎng)殖導(dǎo)致大量有機物沉積，滆湖已退化成為藻型湖泊，呈現(xiàn)重度富營養(yǎng)化狀態(tài)[10]。竺山湖是太湖西北角半封閉型湖灣，經(jīng)雅浦港、太涌運河、殷村港3 條主河道入湖。受入湖河道來水水質(zhì)污染較重的影響， 竺山湖的水質(zhì)常年為劣V 類，是太湖區(qū)域水質(zhì)污染最嚴(yán)重的區(qū)域[11]，因水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象十分嚴(yán)重，藍(lán)藻水華現(xiàn)象爆發(fā)頻繁[12]。 通過各種途徑進(jìn)入河道、湖體的污染物富集于湖泊底質(zhì)，被湖泊底泥記錄下來， 因此研究者們可通過底泥中微生物活性的分析來了解環(huán)境污染狀況和可能存在的污染物類型[13-15]，以便更好地制定相對應(yīng)的生態(tài)環(huán)境質(zhì)量改善措施。

1 實驗部分

1．1 試驗地概況

本次研究以長蕩湖（含錢資蕩）、滆湖、太湖竺山湖3 個湖泊為研究對象， 分別按照水流的方向在上游、湖中和下游位置選取了3 個具有代表性的點位。 其中錢資蕩湖泊面積較小，選1 個點位，滆湖作為備用水源地，在取水口增設(shè)1個點位。 具體采樣點見圖1。

圖1 洮滆水系采樣點位

1．2 儀器與試劑

儀器：恒溫培養(yǎng)箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；Gen III MicroStation 微生物分類鑒定系統(tǒng)（美國BIOLOG 公司）；離心機（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）。 ECO MICROPLATE （美國BIOLOG 公司）、無菌密封袋、玻璃珠、無菌瓶。 試劑：0．9%生理鹽水。

1．3 研究方法

（1）Biolog 試驗

Biolog-Eco 板接種和培養(yǎng):取冷凍沉積物樣品于4 ℃過夜，稱取5 g（濕重）至裝有45 mL 無菌生理鹽水的廣口瓶（含玻璃珠）中，于旋轉(zhuǎn)振蕩器上180 r/min振蕩30 min， 靜置； 取上清液30 mL 于50 mL 離心管，以600 r/min 離心10 min，取離心后上清接種至Biolog-Eco 板（Biolog Inc，USA） 上， 每孔加入150 μL， 28 ℃恒溫避光培養(yǎng)， 用Biolog Reader（Biolog Inc，USA）讀 取培 養(yǎng)0，24，48，72，96，120，144，168，192 h 時590 nm （顏色+濁度）和750 nm（濁度）波長的光密度值[14]。

（2）Biolog 數(shù)據(jù)分析

Biolog-Eco 板的AWCD 計算方法：先將單孔在590 和750 nm 的光密度值分別減去對照孔光密度值，再用每個對應(yīng)590 nm 的光密度值減750 nm 的光密度值（表示為C590-750），得到單孔實際顏色反應(yīng)的光密度值，數(shù)值小于0．06 時將數(shù)值默認(rèn)為0。 則，31 為Biolog-Eco 板上供試碳源的種類數(shù)。

以培養(yǎng)時間72 h 的試驗結(jié)果為計算樣本，分別計算底物碳源利用數(shù)（S），Shannon-wiener 多樣性指數(shù)（H′）和Pielou 均勻度指數(shù)（J）。 其中：，為單孔相對光密度值，即：J=H′/lnS。

2 結(jié)果與分析

2．1 微生物整體代謝活性

AWCD 能夠體現(xiàn)微生物群落利用Biolog-ECO全部碳源的能力， 是微生物活性及其群落功能多樣性的重要指標(biāo)。 洮滆水系不同點位微生物群落的AWCD 變化見圖2。 由圖2 可以看出，長蕩湖中，除錢資蕩微生物代謝活性較低外， 其余的3 個點位的微生物代謝活性趨同。其中北干和湖心的AWCD 最大值稍大于洮西，但都極大于錢資蕩。滆湖4 個點位AWCD 最大值差異較明顯，北干河口＞繁保區(qū)＞取水口和殷村港。北干河口位于河岸西側(cè)，與長蕩湖依北干河連接，AWCD 最大值也與長蕩湖北干點的AWCD 值相近。 殷村港和取水口點位于河岸東側(cè)，底泥與西岸的2 點有所差異。太湖竺山湖中，百瀆港和竺山湖中2 個點位的AWCD 變化趨勢與最大值相似，明顯高于椒山。 竺山湖是一個半封閉型湖灣，百瀆港與竺山湖中2 個點位由于地理位置受人類生產(chǎn)活動影響居多，整體代謝性趨同，椒山外延至太湖西側(cè)，受人為干擾較少，AWCD 最大值則較低。 各點位的微生物群落AWCD 值的變化率、最大值均有顯著差異。 北干河口、 百瀆港和竺山湖中代謝活性最高，繁保、北干、湖心、洮西次之，取水口、殷村港、錢資蕩和椒山代謝活性最低。 總體而言微生物整體代謝能力是竺山湖＞滆湖＞長蕩湖。

圖2 洮滆水系不同點位微生物群落的AWCD 變化

2．2 微生物碳源代謝多樣性

選取微生物培養(yǎng)72 h 時的光密度值，根據(jù)多樣性指數(shù)公式分別計算豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)，采用SPSS17．0 軟件中的Tukey HSD 檢驗方法對其進(jìn)行差異檢驗。 不同點位微生物群落碳源代謝的豐富度（R），H'和J 統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 不同點位微生物群落碳源代謝R，H'，J

由表1 可知，各點之間豐富度的差異較為明顯，北干河口、繁保區(qū)、竺山湖中、湖心大于北干、百瀆港、洮西、取水口、殷村港、椒山大于錢資蕩，3 個湖泊的落碳源代謝的R，H' 和J 均為湖泊中部區(qū)域大于沿岸， 原因可能是由湖泊沿岸人類活動、 農(nóng)田種植、排水灌溉及畜牧養(yǎng)殖等污染的輸入所致，各類有機污染物進(jìn)入通過沿岸的面源擴散、 入湖河道和溝渠排放進(jìn)入水體， 使得沿岸底質(zhì)中碳源來源更為多樣， 造成利用不同碳源的各類微生物的物種數(shù)量要多于湖泊中部點位。 而3 個湖泊間的微生物多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)則差異不大， 說明湖泊各點位的微生物群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性差別不明顯。

2．3 微生物群落對于不同類型碳源的利用

Biolog ECO 板上將微生物可利用的31 種碳源分為6 大類：糖類、氨基酸類、脂類、醇類、胺類和酸類，分類方法見表2。 每種不同的有機碳源將作為微生物的唯一能量來源， 通過對碳源利用結(jié)果來產(chǎn)生微生物代謝特征指紋。

表2 ECO 板碳源分類

洮滆水系長蕩湖、滆湖、竺山湖微生物群落對6類碳源的相對利用率差異見圖3。 長蕩湖中錢資蕩對于脂類的利用率最高，達(dá)到了35．56%，對胺類、氨基酸類和醇類的利用率則次之， 分別達(dá)到22．44%，17．15%和14．05%， 對于酸類和糖類的利用率最低，只有7．54%和3．26%。 長蕩湖的其他幾個點位對于碳源的利用率較為相同，都是對糖類、氨基酸、脂類和胺類的利用率較高，在20%左右，對于醇類和酸類的利用率則明顯偏低。滆湖的4 個點位對于糖類、氨基酸、脂類和胺類的利用率都大似相近，對于酸類的利用率較低；對于醇類則是最低，其中北干河口只有7．34%； 對于胺類的利用率則相對偏高，為22．52%。 繁保區(qū)對各個碳源的利用率基本超過了15%，但是對醇類的利用率較為偏低，只有12%。 取水口對于醇類和酸類的利用率都比較低且都不超過10%，對于其余4 種碳源的利用率則比較相似。殷村港除了對醇類的利用率較低只有8．77%， 對于酸類的利用率在15%，對于其余4 種碳源的利用率都在19%左右。 整個竺山湖水系對醇類和酸類的利用率不是很高，在10%～13%之間。其中百瀆港在3 個點位中對于糖類的利用率最高，達(dá)到了20%，而竺山湖中和椒山都只有13．8%。 竺山湖中對于氨基酸的利用率明顯高于其余2 個點，由23．45%。 不得不指出，3 個點對于脂類的利用率均很高，而椒山的利用率已經(jīng)達(dá)到了28．57%。

由圖3 可以看出， 洮滆水系從上游至下游分布的3 個湖泊長蕩湖、滆湖、竺山湖對6 種碳源的利用存在一定差異。 整個洮滆水系所有采樣點位微生物對于醇類和酸類的利用率都偏低。 除錢資蕩對于脂類的利用率最高， 其余點位對碳源的利用率較為平均。 滆湖對氨基酸類、脂類和胺類的利用率較高，竺山湖對脂類的利用率較高。 不同樣的微生物群落對于碳源利用能力的差異，可以看做是土壤微生物群落演替的結(jié)果[16]。 各湖泊之間底泥微生物對于碳源利用能力的差異不大造成的原因可能是3 個主要湖泊長蕩湖、滆湖、竺山湖底泥多年來碳源攝入渠道固定，底泥中微生物在演替過程中逐漸適應(yīng)環(huán)境，群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。 但錢資蕩由于近年來被改造成金壇區(qū)城市生態(tài)濕地公園，周邊工廠搬遷，湖內(nèi)不再允許捕魚， 所以流入湖內(nèi)的碳源種類開始變?yōu)橐灾悶橹鳎?造成錢資蕩的微生物群落功能代謝性差異明顯。

圖3 洮滆水系長蕩湖、滆湖、竺山湖微生物群落對6 類碳源的相對利用率差異

3 結(jié)論

（1）微生物整體代謝能力體現(xiàn)出錢資蕩＜長蕩湖＜滆湖＜竺山湖的趨勢，反應(yīng)出高度的空間差異性。 洮滆水系下游湖泊如竺山湖沉積物中的微生物代謝能力最強，上游湖泊長蕩湖（錢資蕩）最弱。說明從水流方向上從上至下， 水體中的有機污染物逐漸增多，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的增加，下游各湖泊微生物代謝能力逐級增強。

（2）3 個湖泊間的微生物豐富度沿岸大于湖中區(qū)域，也同樣反映出靠近污染物輸入的區(qū)域，底質(zhì)中有機污染物質(zhì)濃度更高， 導(dǎo)致了微生物豐富度的差異。而微生物多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)差異不顯著，則表明各點位的微生物群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性差別較小， 說明了上下游輸入的有機污染物類別差異不大，不存在有顯著特征其它碳源。

（3）位于洮滆水系中游的滆湖底物碳源利用數(shù)最多， 可能因為是滆湖處在連接上下游水體的水系交匯處。 除錢資蕩底泥微生物對脂類的利用率最高外， 各湖泊之間底質(zhì)微生物對于不同碳源利用的差異性較低， 同樣反映出整個洮滆水系的碳源或者外來污染物基本相似。