翁國武周真真

海南省第三人民醫(yī)院（三亞中心醫(yī)院）消化科（海南三亞572000）

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年升高且發(fā)病人群呈年輕化趨勢[1-2]。由于早期胃癌的癥狀隱匿、診斷難度大，多數(shù)胃癌患者確診時已經(jīng)為中晚期，治療效果及預后情況均較差。盡管近年來外科手術技術不斷進步、新的化療藥物及靶向藥物也陸續(xù)問世和應用，但胃癌患者的治療效果仍不理想，治療過程中腫瘤的復發(fā)和轉移會直接影響預后。因此，越來越多的學者致力于探究胃癌發(fā)病的分子機制并尋找靶向治療胃癌的新手段。

微小RNA（microRNA，miR）是一種在轉錄后水平抑制基因表達的非編碼小分子RNA，多種miR 被證實在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中存在低表達或高表達[3-5]。在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，也有多種miR的表達發(fā)生改變[6-8]；其中miR-19a在胃癌病灶及胃癌患者外周血中均呈高表達的趨勢[9-11]且抑癌基因自殺相關因子（factor associated suicide，F(xiàn)as）的mRNA 序列中存在miR-19a的結合位點，從生物信息學角度推測miR-19a 能夠靶向抑制Fas的表達并起到促癌活性，但miR-19a在胃癌中的具體生物學作用仍未見明確報道。因此，為了闡明miR-19a在胃癌發(fā)生發(fā)展所發(fā)揮的作用及發(fā)揮作用的機制，本實驗具體分析了miR-19a通過Fas 基因調(diào)節(jié)胃癌細胞增殖水平的作用，進而能夠為深入認識胃癌發(fā)病機制、探尋胃癌新的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌SGC-7901細胞株購自中科院上海細胞資源中心。雄性BALB/c 小鼠購自菲諾克生物科技（上海）有限公司，體質(zhì)量20～25 g、4～6周齡，許可證號：SCXK（滬）2018-0005。

miR-19a 模擬物、陰性對照（NC）模擬物、Fas的siRNA、NC的siRNA 購自上海吉瑪公司，儲存液濃度為20 mmol/L；過表達Fas 基因的pcDNA3.1 質(zhì)粒購自上海生工公司，儲存液濃度為2.5 mg/mL；雙熒光素酶報告基因購自Promega公司；細胞增殖活力的MTS細胞活力檢測試劑盒購自Promega公司，細胞凋亡的TUNEL檢測試劑盒購自上海碧云天公司，miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京康為世紀公司，F(xiàn)as 單克隆一抗購自Abcam公司。細胞培養(yǎng)箱、高速離心機購自Thermo公司，熒光定量PCR 儀購自ABI公司，正置顯微鏡購自Nikon公司，化學顯影儀購自Bio-rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及干預SGC-7901細胞株用含有10%胎牛血清的DMEM 貼壁培養(yǎng)，鋪滿培養(yǎng)板底面90%后用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代，傳代后的細胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)并分組干預。NC組用不含藥物的DMEM 處理，NC 模擬物組轉染NC 模 擬 物，miR-19a 組 轉 染miR-19a的模 擬 物，siRNA-NC 組轉染NC的siRNA，siRNA-Fas 組轉染Fas的siRNA，NC 質(zhì)粒組轉染空白的pcDNA3.1 質(zhì)粒，NC 質(zhì) 粒+miR-19a 模 擬 物 空 白的pcDNA3.1 質(zhì)粒及miR-19a的模擬物，F(xiàn)as 質(zhì)粒+miR-19a 模擬物組轉染過表達Fas 基因的pcDNA3.1 質(zhì)粒及miR-19a的模擬物，連續(xù)干預24 h。

1.3 移植瘤小鼠模型建立及干預取消化后的SGC-7901細胞，調(diào)整至細胞密度為5 × 107個/mL的細胞懸液，取200 μL細胞懸液接種至小鼠右側腋下的皮下，1周后腫瘤生長至0.5 cm3后認為胃癌移植瘤小鼠造模成功，共15只小鼠、造模成功率100%。造模成功后，小鼠隨機分為NC 組、NC 模擬物組、miR-19a 模擬物組，每組各5只，從造模成功當天開始干預，3 組小鼠分別沿著腫瘤周圍不同部位注射200 μL的生理鹽水、NC 模擬物、miR-19a 模擬物，每3 天注射1次、共注射7次，末次注射后3 d處死小鼠，解剖得到移植瘤并稱重，而后將移植瘤放置在液氮中保存。

1.4 miR-19a表達量檢測取分組干預24 h后的SGC-7901細胞，用miRNA 提取試劑盒分離細胞中的miRNA，用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒將miRNA 反轉錄為cDNA，用miRNA 熒光定量PCR檢測試劑盒對cDNA 中的miR-19a及U6進行擴增，擴增條件為95℃預變性3 min后95℃5 s、60℃15 s 重復40個循環(huán)，自動生成循環(huán)曲線及閾值后、以U6為內(nèi)參、計算miR-19a的表達量。

1.5 細胞增殖活力檢測取分組干預24 h后的SGC-7901細胞，將MTS 試劑盒中的檢測液20 μL加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出培養(yǎng)板，放置在酶標儀上檢測490 nm波長處的吸光值、為OD490值。

1.6 細胞凋亡率檢測取分組干預24 h后的SGC-7901細胞，4%多聚甲醛固定0.5 h后立即用TUNEL 試劑盒（綠色熒光法）進行染色并在顯微鏡下觀察TUNEL 陽性染色及DAPI 陽性染色的細胞數(shù)，計算細胞凋亡率。

1.7 Fas蛋白表達量檢測取分組干預24 h后的SGC-7901細胞及液氮冷凍的移植瘤，用RIPA 裂解液裂解細胞、提取蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白含量后取30 μg蛋白進行免疫印跡實驗。將蛋白樣本加入SDS-PAGE 中，電泳、電轉膜后將NC 膜放入5%脫脂牛奶中、室溫孵育1 h，而后將NC 膜放入1∶1 000 稀釋的Fas 一抗或1∶5 000 稀釋的β-actin一抗中、4℃孵育過夜；次日，將NC 膜放入1∶2 000稀釋的二抗中、室溫孵育1 h，最后加入ECL 顯影液、在化學顯影儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值、以β-actin為內(nèi)參計算蛋白表達量。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測構建包含F(xiàn)AS 基因mRNA 3′UTR的雙熒光素酶報告基因，將雙熒光素酶報告基因與NC 模擬物或miR-33b 模擬物共同轉染進入細胞，24 h后用0.25%胰蛋白酶消化細胞并離心，得到細胞沉淀后采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定螢火蟲熒光值和海腎熒光值，以螢火蟲熒光值/海腎熒光值計算熒光素酶報告基因的熒光活性。

1.9 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0軟件錄入數(shù)據(jù)，3 組間計量資料的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-19a對胃癌細胞增殖及凋亡的調(diào)節(jié)作用與NC 組、NC 模擬物組比較，miR-19a 模擬物組細胞中miR-19a的表達量、細胞增殖活力OD490值均明顯增加，細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 轉染miR-19a 模擬物后的miR-19a表達量、增殖活力及凋亡率Fig.1 miR-19a expression，proliferation viability and apoptosis rate after the transfection of miR-19a mimic

2.2 miR-19a對胃癌細胞中Fas 基因的靶向調(diào)節(jié)作用經(jīng)TargetScan進行生物信息學分析，F(xiàn)as 基因mRNA的3′UTR 上含有miR-19a的結合位點。與NC 模擬物組、NC 組比較，miR-19a 模擬物組細胞中Fas的蛋白表達量、熒光素酶報告基因的熒光值均均明顯減少（P＜0.05）。見圖2。

2.3 沉默F(xiàn)as 基因對胃癌細胞增殖及凋亡的調(diào)節(jié)作用與siRNA-NC 組、NC 組比較，siRNA-Fas 組細胞中Fas的蛋白表達量、細胞增殖活力OD490值均明顯增加，細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

2.4 過表達Fas 基因對miR-19a 調(diào)控胃癌細胞增殖及凋亡的影響與NC 質(zhì)粒組比較，NC 質(zhì)粒+miR-19a 模擬物組的細胞增殖活力OD490值均明顯增加，F(xiàn)as的蛋白表達量、細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與NC質(zhì)粒+miR-19a模擬物組比較，F(xiàn)as質(zhì)粒組+miR-19a 模擬物的細胞增殖活力OD490值均明顯降低，細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。見圖4。

2.5 miR-19a對胃癌移植瘤生長及Fas 基因表達的影響與NC 模擬物組、NC 組比較，miR-19a 模擬物組的移植瘤質(zhì)量明顯增加，移植瘤中Fas的蛋白表達量均明顯減少（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

癌細胞過度增殖是與胃癌發(fā)生及治療過程中復發(fā)、轉移密切相關的生物學環(huán)節(jié)，分析胃癌細胞增殖的調(diào)控方式有助于闡明胃癌發(fā)生的機制、也能夠為探尋新的靶向治療手段提供依據(jù)。近年來，多種miR在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用均受到關注，miR-19a是一種具有促癌作用的miR，在肝癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、腎癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤中均被證實能促進癌細胞的增殖[12-18]。胃癌相關的臨床研究證實，胃癌病灶及胃癌患者外周血中miR-19a 均呈顯著高表達的趨勢[6-8]，提示miR-19a可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。基于此，本實驗以胃癌SGC-7901細胞為對象、通過分析miR-19a對癌細胞增殖的調(diào)控作用及機制來闡明miR-19a在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用。

圖2 轉染miR-19a 模擬物后Fas 基因的表達量Fig.2 Fas gene expression after the transfection of miR-19a mimic

圖3 轉染Fas siRNA后的Fas表達量、增殖活力及凋亡率Fig.3 Fas gene expression，proliferation viability and apoptosis rate after the transfection of Fas siRNA

圖4 轉染Fas 質(zhì)粒后miR-19a對細胞增殖及凋亡的影響Fig.4 Effect of miR-19a on proliferation viability and apoptosis rate after the transfection of Fas plasmid

圖5 miR-19a對胃癌移植瘤生長及Fas 基因表達的影響Fig.5 Effect of miR-19a on gastric cancer transplanted tumors growth and Fas gene expression

在本實驗中，轉染miR-19a的模擬物后，SGC-7901細胞中miR-19a的表達明顯增加；在增加miR-19a的表達后，分別通過MTS 法和TUNEL 法測定了細胞的增殖和凋亡，SGC-7901細胞的增殖活力明顯增強、而凋亡明顯受到抑制，說明miR-19a 能夠促進胃癌細胞增殖且抑制細胞凋亡的發(fā)生可能是其發(fā)揮促增殖作用的機制之一。MiR 具體的生物學作用是與靶基因mRNA的3′UTR 結合并抑制靶基因的表達，本實驗通過targetscan進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，促凋亡基因Fas的3′UTR 上含有miR-19a的結合靶點；在轉染miR-19a的模擬物、增加miR-19a的表達后，細胞中Fas 基因的蛋白表達明顯減少、含有Fas 基因3′UTR的雙熒光素酶報告基因的熒光值明顯下降。以上結果說明miR-19a能夠在SGC-7901細胞中靶向結合Fas 基因mRNA的3′UTR、抑制Fas 基因的表達，這也可能是miR-19a 促進胃癌細胞增殖、抑制胃癌細胞凋亡的分子機制。

Fas 基因的編碼產(chǎn)物是FasL的受體，能夠在細胞內(nèi)招募FADD 并介導死亡受體途徑的細胞凋亡[19-22]。有臨床研究報道，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，F(xiàn)as 基因的表達明顯下調(diào)[23]；也有基礎實驗研究表明，抑制Fas的表達能夠阻礙胃癌細胞的凋亡[24-25]。本實驗已經(jīng)證實miR-19a 能夠靶向抑制Fas 基因的表達，在此基礎上通過轉染Fas 基因的siRNA 來抑制Fas 基因表達、驗證胃癌細胞中Fas 基因表達下調(diào)后的生物學效應。在轉染Fas的siRNA后，細胞中Fas的表達明顯減少、細胞凋亡率明顯下降，而細胞的增殖活力明顯增強，與既往其他研究[24-25]關于Fas 調(diào)控胃癌細胞凋亡及增殖的結果吻合，說明Fas 基因參與胃癌細胞增殖及凋亡的調(diào)控，miR-19a通過抑制Fas 基因的表達能夠削弱Fas 介導的促凋亡效應、進而發(fā)揮抑制凋亡及促進增殖的作用。在此基礎上，本實驗還轉染了過表達Fas 基因的質(zhì)粒來驗證Fas 低表達在miR-19a 發(fā)揮生物學效應中的作用，增加Fas 基因的表達后、miR-19a 增加增殖活力及降低凋亡率的效應均明顯被削弱，由此進一步驗證了miR-19a 能夠通過抑制Fas 基因的表達來促進胃癌細胞增殖、抑制胃癌細胞凋亡。

本實驗在上述細胞學實驗的基礎上，還通過移植瘤小鼠來驗證miR-19a的促癌作用。經(jīng)皮下注射SGC-7901細胞的方式建立了胃癌移植瘤小鼠模型，在瘤周注射miR-19a的模擬物后觀察腫瘤生長及靶基因Fas的表達發(fā)現(xiàn)：miR-19a的模擬物能夠使移植瘤的質(zhì)量增加、同時也使移植瘤中Fas基因的表達減少，這一結果與miR-19a在離體SGC-7901細胞中促進增殖、抑制凋亡、減少Fas 基因表達的作用吻合，說明miR-19a 能夠促進胃癌的生長。

綜上所述，本研究首次闡明了miR-19a對胃癌細胞的增殖具有促進作用，靶向抑制Fas 基因介導的細胞凋亡是miR-19a 發(fā)揮促增殖作用的分子機制之一，這也是本研究的創(chuàng)新之處，基于此，未來miR-19a可能可以作為治療胃癌的靶點。本研究的局限及不足之處是未能對胃癌中miR-19a表達的上游調(diào)控機制進行探究，在未來的研究中，可以進一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀的方式來篩選與miR-19a 基因轉錄本上游結合的轉錄因子，進而研究不同轉錄因子對胃癌中miR-19a表達的調(diào)控作用。