韋卓利 陶露 武世伍 宋早智項平

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實驗室病理科（安徽蚌埠233004）

據(jù)全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)估計，2018年全世界有近130萬前列腺癌新發(fā)病例和359 000例相關(guān)死亡病例，是男性中第二大癌癥和第五大癌癥死亡原因[1]，五年生存率為72.6%[2]。目前前列腺癌臨床預(yù)后風(fēng)險分級使用術(shù)前PSA 值，cTNM和Gleason評分是公認(rèn)的，然而，有研究發(fā)現(xiàn)，即使患者具有相同的PSA，Gleason 評分和T 分期，其預(yù)后也可能完全不同[3-5]。因此，需要探索更好的預(yù)后指標(biāo)來幫助預(yù)測不同前列腺癌患者。電壓門控鈉離子通道β4 亞基（SCN4B）作為α亞基的輔助亞基，不僅在細(xì)胞興奮中發(fā)揮重要的作用，還可以作為黏附分子，影響腫瘤細(xì)胞的黏附及遷移活動，定位于人染色體11q23.3 上的β4 亞基，有5個外顯子，編碼228個氨基酸殘基[6-7]。SCN4B在乳頭狀甲狀腺癌、乳腺癌、宮頸癌等腫瘤中[8-10]常表現(xiàn)為低表達(dá)，但有關(guān)SCN4B蛋白在前列腺癌中的表達(dá)與機(jī)制尚不清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)Elivision TM plus 法檢測90例前列腺癌患者腫瘤組織中SCN4B蛋白的表達(dá)，并分析其與前列腺癌患者臨床參數(shù)之間的相互關(guān)系以及對患者生存期的影響。通過構(gòu)建SCN4B 過表達(dá)載體探討SCN4B對前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本及細(xì)胞株收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2011年12月至2015年12月前列腺癌患者的存檔石蠟包埋組織標(biāo)本90例，前列腺癌旁組織標(biāo)本30例作為對照。前列腺癌組織標(biāo)本按照Gleason 評分方法進(jìn)行病理分級；采用AJCC 第八版的TNM 分期系統(tǒng)。所有患者術(shù)前均未行放化療以及其他抗腫瘤治療，均有完整的臨床病理資料及隨訪資料，隨訪截止日期至2018年12月。本研究經(jīng)過蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)及患者的知情同意。前列腺癌細(xì)胞株（LNCAP、PC-3、DU145）購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑兔抗人多克隆抗體SCN4B（1∶100）購買于affinity公司（貨號DF6877），ElivisonTMPlus試劑盒和DAB 顯色試劑盒（福州邁新）。qPCR 引物購自上海生工，試劑盒購自TaKaRa，含有SCN4B的過表達(dá)質(zhì)粒和空白對照質(zhì)粒委托上海吉瑪公司構(gòu)建完成。CCK8 試劑盒購自福州邁新，Transwell小室購自corning公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組化染色方法活檢組織標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋。石蠟標(biāo)本以4 μm/片連續(xù)切片，按照試劑說明書進(jìn)行免疫組化染色。以PBS 代替一抗作陰性對照。 SCN4B蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃褐色。每張切片隨機(jī)選擇3個不同的視野在高倍鏡下觀察，判斷陽性表達(dá)強(qiáng)度和陽性率。采用半定量分析方法對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評分[11]，染色強(qiáng)度計分：0 分（無明顯著色），1 分（弱染色），2 分（中度染色），3 分（強(qiáng)染色）[12]。每個視野陽性細(xì)胞所占的比例計分：1 分（＜25%），2 分（25%～50%），3 分（51%～75%）和4 分（＞75%）。最終得分為染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)的乘積（0～12 分），得分≤6為低表達(dá)，＞6為高表達(dá)。

1.3.2 qRT-PCRTrizol 法提取3 種前列腺癌細(xì)胞株總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照試劑盒說明書操作，以β-actin為內(nèi)參，分別檢測LNCAP、PC-3、DU145細(xì)胞中mRNA表達(dá)。

引物如下：ACTB：上游：5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′，下游：5′-AGGATCTCCGTGCCATTGAC-3′；SCN4B：上游：5′-ACTGGGCTTTTGGGCCTCTT-3′，下游：5′-AGGATCTCCGTGCCATTGAC-3′。反應(yīng)條件：95℃、3 min，95℃、12 s，62℃、40 s，重復(fù)40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，采用2-△△CT法比較基因表達(dá)差異。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)期生長的DU145細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對象，按1×106細(xì)胞/孔的濃度接種6孔板中。培養(yǎng)至70%融合時，根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑說明書分別轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒。細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分為空白對照組（PCDH 組）和過表達(dá)組（PCDH-SCN4B 組）。用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染是否成功。

1.3.4 CCK-8取空白對照組（PCDH組）和過表達(dá)組（PCDH-SCN4B組）細(xì)胞消化后計數(shù)，1×103個/孔接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。在每個時間點(diǎn)更換培養(yǎng)基后加入10 μL CCK8/孔，并將細(xì)胞在37℃孵育2 h。取出后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm（OD450）的吸光度。

1.3.5 Transwell取PCDH 組和PCDH-SCN4B 組細(xì)胞消化后用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，按2×104/孔接種到鋪好基質(zhì)膠的上室中，每孔200 μL；600 μL 含10%FBS的培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)24 h后，取出上室，甲醇固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min后用PBS 洗兩遍。選取4個高倍視野，計數(shù)后取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0 統(tǒng)計分析軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法，組間計量資料比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌和前列腺癌旁組織中SCN4B蛋白的表達(dá)情況90例前列腺癌組織中44例SCN4B蛋白高表達(dá)，30例癌旁組織中有3例低表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 15.740，P＜0.01）。在前列腺癌組織中，SCN4B的表達(dá)與前列腺癌的Gleason 分級、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與患者的年齡、術(shù)前PSA 水平無關(guān)（P＞0.05）（表1、圖1）。SCN4B 高表達(dá)患者的總生存率高于SCN4B 低表達(dá)的患者（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

2.2 3種前列腺癌細(xì)胞株中SCN4B的表達(dá)以高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞DU145為參考對象，PC-3和LNCAP細(xì)胞株中SCN4B表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05，圖3）。

表1 各臨床病理指標(biāo)與前列腺癌組織中SCN4B蛋白質(zhì)的表達(dá)關(guān)系Tab.1 Relationship between clinical pathological parameters and expression of SCN4B protein in prostate cancer tissues

2.3 SCN4B 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染驗證提取PCDH 組和PCDH-SCN4B 組細(xì)胞總RNA，通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后SCN4B表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCDH-SCN4B組SCN4B表達(dá)顯著高于PCDH 組（P＜0.01），證明轉(zhuǎn)染成功（圖4）。

2.4 過表達(dá)SCN4B對細(xì)胞增殖的影響CCK8 增殖實驗檢測結(jié)果說明：與PCDH 組相比，PCDHSCN4B 組的DU145細(xì)胞從第72 h 開始，增殖能力顯著降低（P＜0.05，圖5）。

2.5 過表達(dá)SCN4B對細(xì)胞侵襲的影響Transwell侵襲實驗說明：SCN4B 過表達(dá)顯著抑制DU145的侵襲能力（P＜0.05，圖6）。

圖1 不同病理分期SCN4B 免疫組化結(jié)果（×400）Fig.1 Results of different pathological stages of SCNB4 immunohistochemistry（×400）

圖2 Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示90例SCN4B表達(dá)的前列腺癌患者的預(yù)后Fig.2 Kaplan-Meier survival curve analysis showing the prognosis of 90 patients with SCN4B expressing prostate cancer

圖3 SCN4B在3 種前列腺癌細(xì)胞株的表達(dá)Fig.3 Expression of SCN4B in three prostate cancer cell lines

3 討論

圖4 轉(zhuǎn)染后DU145細(xì)胞中SCN4B的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of SCN4B in DU145 cells after transfection

圖5 SCN4B對細(xì)胞增殖的影響Fig.5 The effect of SCN4B on cell proliferation

圖6 SCN4B對細(xì)胞侵襲的影響Fig.6 The effect of SCN4B on cell invasion

SCN4B是新發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，來自于電壓門控鈉離子通道，可調(diào)節(jié)鈉離子通道，誘導(dǎo)產(chǎn)生復(fù)蘇電流，也可影響鈉通道對動物毒液分子的敏感性。電壓門控鈉離子通道（VGSC）常在神經(jīng)、肌肉、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，近來發(fā)現(xiàn)VGSC 也在某些轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞中表達(dá)[13-14]，研究[15-18]表明，它在癌細(xì)胞中的表達(dá)增加了癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。VGSC在腫瘤的轉(zhuǎn)移中有著重要的作用，其腫瘤機(jī)制復(fù)雜多變，目前的研究發(fā)現(xiàn)主要與以下因素有關(guān)[19-20]：（1）作為黏附分子，改變細(xì)胞形態(tài)，影響癌細(xì)胞的侵襲遷移；（2）調(diào)節(jié)α亞基的活性；（3）調(diào)節(jié)相互作用蛋白的表達(dá)量。

本研究證實了SCN4B蛋白在前列腺癌組織中存在表達(dá)，且SCN4B的陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織（P＜0.01），并隨著病理分期（T 分期）和Gleason 分級的增高SCN4B蛋白表達(dá)水平逐漸降低（P＜0.05），而與患者的年齡、術(shù)前PSA 水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），通過K-M 生存分析表明SCN4B 低表達(dá)的患者相對于SCN4B 高表達(dá)的患者有著較差的預(yù)后，說明SCN4B蛋白可能參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。然后本研究通過qRT-PCR檢測SCN4B在人前列腺癌細(xì)胞株（LNCaP，DU145和PC-3）中的表達(dá)高低，結(jié)果表明SCN4B在DU145細(xì)胞株中表達(dá)最低。選擇DU145細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，與空白組進(jìn)行對照，驗證了過表達(dá)SCN4B可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

電壓門控鈉通道β亞基（由SCN1B至SCN4B 基因編碼）已被證明是調(diào)節(jié)細(xì)胞過程如細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移的重要多功能信號分子。HERNANDEZPLATA 等[10]和其他研究表明β4 亞基在一些細(xì)胞，腫瘤組織，和正常組織中表達(dá)有差異。SCN4B/β4亞基在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平比正常的細(xì)胞表達(dá)水平低，但在活檢中結(jié)果卻相反，可能與其黏附功能在體內(nèi)和體外條件不同有關(guān)。BON 等[9]的研究證明SCN4B/β4 亞單位在正常的乳腺癌上皮細(xì)胞和組織中表達(dá)，但在侵略性癌細(xì)胞和腫瘤中表達(dá)下降。SCN4B/β4的缺失通過RhoA 依賴性信號傳導(dǎo)途徑增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移形成，獨(dú)立于成孔NaV 亞基。SCN4B 過表達(dá)減少了癌細(xì)胞侵襲和腫瘤進(jìn)展，表明SCN4B/β4 代表抑制基因。GONG等[8]采用回顧性研究，通過生物信息學(xué)分析癌癥基因組圖譜（TCGA）表明：SCN4B的表達(dá)是乳頭狀甲狀腺癌無復(fù)發(fā)存活的獨(dú)立指標(biāo)，同時還發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)可能被DNA 高甲基化抑制，但不太可能受DNA 拷貝數(shù)改變/突變的影響。本研究與此相符，由此，筆者推測SCN4B的低表達(dá)影響了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

本文通過研究分析表明，SCN4B在前列腺癌中通過抑制腫瘤的增殖和侵襲發(fā)揮抑癌基因的作用，并對其診斷有重要意義。但是，這項研究也存在一些不足。首先，臨床標(biāo)本樣本量相對較小。其次，SCN4B通過何種信號通路參與PCa的調(diào)控機(jī)制未涉及，以及裸鼠成瘤體內(nèi)實驗的驗證。接下來將通過進(jìn)一步的實驗探討SCN4B 與前列腺癌轉(zhuǎn)移之間的分子機(jī)制以及體內(nèi)實驗的驗證?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)SCN4B在前列腺癌組織中低表達(dá)，而且，相對于SCN4B 高表達(dá)患者總體五年生存率降低。通過細(xì)胞功能實驗證明，過表達(dá)SCN4B可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究對前列腺癌的診斷以及病情監(jiān)測有一定意義。