張忠興，蔡 俊

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)體育部，安徽合肥230032；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)體育部，安徽合肥230032）

隨著霧霾等環(huán)境污染加劇，肺癌發(fā)病率及致死率已經(jīng)成為眾多惡性腫瘤中致死率最高的癌癥[1]。依據(jù)病理類型可將肺癌分為小細(xì)胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)為肺癌診斷提供了更為先進(jìn)的硬件支持，但肺癌早期臨床癥狀不明顯且其精準(zhǔn)性有所欠缺，同時(shí)約75%的肺癌患者處于晚期，治療效果有限。因此，尋求更為有效的肺癌干預(yù)治療是醫(yī)學(xué)科研人員的首要任務(wù)[2-4]。目前，非小細(xì)胞肺癌的臨床治療主要有手術(shù)、化療和放療。然而，雖然西藥的放療、化療在治療肺癌細(xì)胞方面有一定的效果，但同時(shí)對(duì)正常機(jī)體細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生不同程度的損傷，使得機(jī)體的免疫功能嚴(yán)重下降[5-6]。中藥是通過(guò)多成分多靶點(diǎn)作用于腫瘤細(xì)胞，因此臨床上運(yùn)用中醫(yī)手段在治療肺癌方面具有先天優(yōu)勢(shì)。多項(xiàng)研究證實(shí)，在合理運(yùn)用中藥治療肺癌的方案下，肺癌患者免疫狀況會(huì)有不同程度的改善且延長(zhǎng)生存期。黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge. var. mon-gholicus(Bge.) Hsiao、膜 莢 黃 芪Astragalus membranaceus(Fisch)的根[7]。黃芪多糖是黃芪中最重要的天然活性成分[9-11]，它具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、降血糖、抗氧化延緩衰老的功能[12-16]。有氧運(yùn)動(dòng)作為整合醫(yī)學(xué)的重要組成部分能降低腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[17]，通過(guò)適度有氧運(yùn)動(dòng)能影響性激素、胰島素及胰島素樣等生長(zhǎng)因子的分泌，改變體脂的組成并提高免疫細(xì)胞數(shù)值從而間接抑制腫瘤[18-19]。因此，借助有氧運(yùn)動(dòng)同時(shí)結(jié)合黃芪多糖探索兩者對(duì)肺癌小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為臨床肺癌的防治提供一種新的方法，同時(shí)也增強(qiáng)人們強(qiáng)身健體的意識(shí)。

1 材料與方法

（1）藥材與儀器。黃芪購(gòu)買于衢州華豐藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20150521），生物安全柜（LABCONCO Class II、美國(guó)Labconco 公司），培養(yǎng)箱（HERA Cell CO2，美國(guó)熱電集團(tuán)），倒置相差顯微鏡（COIC XDS-1B，重慶光電儀器總公司）；安科TDL-40B離心機(jī)，紫外消毒車（ZXC型，安徽聚光電科技有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（UV-2802，Shanghai Unico Instrument Co.，Ltd），十萬(wàn)分之一的分析天平（METLER TOLEDO Analytical Instruments Co.，Ltd），其余所用試劑均為分析純。

（2）黃芪多糖含量測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將1.0 mg 葡萄糖參考物置于10 mL 容量瓶中，加蒸餾水，制備濃度為100.0 μg/mL的對(duì)照溶液。精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL帶塞試管中并加水至2.0 mL，后加入6 mL硫酸-苯酚溶液。搖動(dòng)均勻并加熱15 min后取出，迅速冷卻15 min，用水作為空白對(duì)照，按照UV-VIS分光光度法，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃芪多糖含量測(cè)定[20-22]。精確稱取1.0 g多糖粉末，用蒸餾水溶解至50 mL，準(zhǔn)確吸取1.0 mL并測(cè)量吸光度。

（3）Lewis癌瘤細(xì)胞懸液的制備[23-24]。當(dāng)Lewis肺癌細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞并以2 000 r/min離心2 min，然后再次收集底部細(xì)胞。將細(xì)胞用無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）制備成細(xì)胞懸浮液，置顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整至細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL，并接種到4 只C57BL/6 小鼠的右腋窩。當(dāng)移植腫瘤的體積為50～100 mm3時(shí)，將無(wú)自發(fā)性出血、壞死及感染的腫瘤小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。5天后，處死接種Lewis肺癌細(xì)胞的小鼠并置于乙醇中浸泡2 min，按腫瘤質(zhì)量（g）與細(xì)胞培養(yǎng)基（mL）1:10磨成勻漿，多次離心棄去上清液，最后與培養(yǎng)基混合制成20 mL肺癌瘤細(xì)胞懸浮液。

（4）建立荷瘤小鼠模型、動(dòng)物分組和給藥。將0.2 mL肺癌細(xì)胞懸浮液分別皮下接種到60只C57BL/6小鼠中。10只無(wú)腫瘤細(xì)胞的小鼠作為空白組（A），其他每10只小鼠一組，隨機(jī)分為6組：模型組（B），陽(yáng)性藥組（環(huán)磷酰胺，20 mg/kg）（C），黃芪多糖高（400 mg/kg）（D）、低（100 mg/kg）劑量組（E），黃芪多糖（400 mg/kg）輔助游泳30 min（F），黃芪多糖低劑量（100 mg/kg）輔助游泳30 min（G）。

（5）小鼠瘤塊、免疫器官和血液樣品的收集。每組小鼠眼睛采集1 mL血液。抑制率[25-27]為模型組的平均腫瘤重量減去實(shí)驗(yàn)組的平均腫瘤重量再除以模型組的平均腫瘤重量后乘以100；臟器指數(shù)[25-26]主要包括胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

（6）蛋白免疫印跡分析RORγt 和FOXP3 蛋白在肺癌中的表達(dá)。將剖解的腫瘤組織用PBS（Phosphate Buffer Saline）緩沖溶液洗滌兩次，并用RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液裂解組織（400 μL RIPA+4 μL PMSF（Phenylmethylsulfonyl Fluoride)提取總蛋白。通過(guò)BCA(butyleyanoacrylate)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并將50 μg 蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳（Polyacrylamide gel Electrophoresis）。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（Polyvinylidene Fluoride）上，使用RORγt 抗體（retinoid-related orphan receptor subfamily，ROR）中RORγ 特異性表達(dá)在免疫細(xì)胞上的亞型、FOXP3（Forkhead Box Protein 3）抗體（1：1）和β-actin兔多克隆抗體（1:500）孵育，室溫振搖180 min。用TBS（Tris-Buffered Saline）洗滌3次，10 min/次。

（7）PCR（Polymerase Chain Reaction）檢測(cè)RORγt 和FOXP3 mRNA 水平的變化。收集各組細(xì)胞（約1×107個(gè)），根據(jù)mRNA表達(dá)Trizol一步法說(shuō)明提取總RNA，并測(cè)定其純度及濃度。根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA。以GAPDH 作為內(nèi)參，引物由華大基因公司合成。RORγt 引物：上游5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’,下游5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’;FOXP3引物：上游5’-GCTGGTCGGGAGAAGAGGA-3’,下游5’-CAGTATCCCACGGAAATAACCT-3’。按照TaKaRa 試劑盒說(shuō)明，選擇10 μL 的反應(yīng)體系，包括SYBRPremix Ex Taq II(2X)5 μL cDNA 模板0.8 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，dH2O 3.4 μL。擴(kuò)增條件：95°C預(yù)熱30 s；95°C變性5 s，退火溫度30 s，擴(kuò)增39個(gè)循環(huán)；最后65°C延伸5 s；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。使用各組中的基因表達(dá)與內(nèi)部參照β-actin肌動(dòng)蛋白的比率作為參照表達(dá)值。

（8）黃芪多糖對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+/CD8+的影響。將100 μL全血和1 mL FACS（Fluorescence Activated Cell Sorting）RBC裂解物（Red Blood Cell Lysis Buffer）分別加入1.5 mL EP管（Microcentrifuge Tube）中并充分混合，室溫靜置10 min。按照檢測(cè)要求在各管中加入適量小鼠APC-CD4（Antigen Presenting Cell-Cluster of Differentiation 4）、PE-CD8a抗體（CD8A Monoclonal Antibody），1 000 r/min離心5 min，加入1 mL洗滌液搖勻并混合，向每個(gè)管中加入500 μL PBS洗液并搖動(dòng)混合。

（9）數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)全部采用SPSS 16.0進(jìn)行處理，并且使用t檢驗(yàn)比較組之間數(shù)據(jù)，用±s表示，P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪多糖含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芪多糖含量濃度為0.01～0.89 mg/mL，呈線性關(guān)系，線性回歸方程為（n=6）：Y =0.639 8 X+0.019 2（R2=0.997 3）。計(jì)算得到黃芪多糖含量為2.071 5 g/mL。

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖對(duì)肺癌小鼠免疫器官的調(diào)節(jié)

圖1為相應(yīng)配方分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖可顯著提高脾臟指數(shù)（P＜0.05），胸腺指數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定，而環(huán)磷酰胺組抑制脾臟和胸腺的生長(zhǎng)（P＜0.05）。因此，推測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)與黃芪多糖聯(lián)合應(yīng)用腫瘤免疫器官的萎縮有較明顯效果。

圖1 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖對(duì)小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖對(duì)Lewis小鼠肺癌RORγt和FOXP3蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，模型組的RORγt蛋白水平顯著高于空白組（P＜0.05），而環(huán)磷酰胺顯著降低RORγt蛋白水平（P＜0.05）。與黃芪多糖高、低劑量組相比，有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖高、低劑量組顯著降低RORγt的蛋白水平（P＜0.05）。與空白組相比，模型組FOXP3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），已降低的FOXP3 蛋白水平在環(huán)磷酰胺的作用下有顯著性提高（P＜0.05）。高、低劑量黃芪多糖和有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖顯著地提高了FOXP3的蛋白水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，黃芪多糖通過(guò)降低RORγt和升高FOXP3蛋白水平，調(diào)節(jié)肺癌免疫作用，有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖的調(diào)節(jié)作用更強(qiáng)。

圖2 黃芪多糖對(duì)荷瘤小鼠免疫蛋白水平的調(diào)節(jié)作用

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖對(duì)Lewis肺癌小鼠RORγt和FOXP3 mRNA表達(dá)的影響

如圖3 所示，模型組中RORγt 的mRNA 水平顯著高于空白組（P＜0.05），已升高的mRNA 水平在環(huán)磷酰胺作用下有顯著性降低（P＜0.05）。高、低劑量組黃芪多糖和有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖高、低組對(duì)RORγt的mRNA水平有顯著影響（P＜0.05）。與高、低劑量黃芪多糖組相比，有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合高、低黃芪多糖組可顯著地降低RORγt 的mRNA 水平（P＜0.05）。與空白組相比，模型組FOXP3 的mRNA 水平顯著降低（P＜0.05）；FOXP3的mRNA在環(huán)磷酰胺作用下有顯著性提高（P＜0.05）；高、低劑量黃芪多糖和有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖高、低組顯著地提高了FOXP3的mRNA水平（P＜0.05）。與高、低劑量黃芪多糖組相比，有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合高、低黃芪多糖可顯著提高FOXP3 的mRNA 水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，黃芪多糖對(duì)肺癌免疫有一定的調(diào)節(jié)作用，有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。

圖3 黃芪多糖對(duì)荷瘤小鼠RORγt和FOXP3 mRNA水平的調(diào)節(jié)

2.5 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖恢復(fù)外周血CD4+/CD8+比值

CD4+和CD8+T 細(xì)胞在免疫抗腫瘤中起重要作用，并且在癌癥患者體內(nèi)常常伴隨著二者的比例下降，而這種不正常的比例關(guān)系會(huì)阻礙T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞，造成免疫抑制。如圖4所示，模型組中CD4+/CD8+比例顯著低于空白組（P＜0.05）。環(huán)磷酰胺可以損害身體的免疫功能，并且還顯著性導(dǎo)致兩個(gè)T細(xì)胞亞群的不平衡（P＜0.05）。高劑量和低劑量的黃芪多糖可顯著提高CD4+水平（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)聯(lián)合高、低劑量黃芪多糖可顯著提高CD4+水平，其指數(shù)也分別高于黃芪多糖高低劑量。結(jié)果表明，黃芪多糖可改善CD4+/CD8+比率失衡，反映了黃芪多糖對(duì)免疫抑制因素的有效調(diào)節(jié)作用，然而有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖具有更好的調(diào)節(jié)作用。

圖4 黃芪多糖對(duì)脾臟中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞比例的影響。

3 討 論

臨床對(duì)肺癌患者采用放療、化療時(shí)，其免疫系統(tǒng)功能會(huì)受到不同水平的影響。腫瘤治療過(guò)程中，免疫器官指數(shù)的穩(wěn)定性是衡量腫瘤患者免疫功能的重要參考。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在腫瘤治療中可調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫抑制狀態(tài)，如由黃芪等組成的益肺顆粒大劑量與環(huán)磷酰胺（cytoxan，CTX）聯(lián)合使用可提高肺癌小鼠胸腺及脾臟的重量系數(shù)[28-31]。RORγt在CD4-、CD8-雙陰性淋巴細(xì)胞上表達(dá)不足，在CD4+、CD8+雙陽(yáng)性淋巴細(xì)胞上高表達(dá)。惡性腫瘤細(xì)胞在與免疫細(xì)胞相互作用的過(guò)程中通過(guò)Janus蛋白酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白（Janus kinase-signal transducers and activators of transcription,JAK-STAT）信號(hào)通路或核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）過(guò)表達(dá)IDO（Indoleamine），使得細(xì)胞微環(huán)境中色氨酸消耗，進(jìn)而導(dǎo)致外周血中犬尿氨酸的增加，T細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生影響而引起細(xì)胞凋亡。最終，腫瘤微環(huán)境中的外周T細(xì)胞的免疫功能減弱或失效[32]。本研究中發(fā)現(xiàn)黃芪多糖組能維持小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)平穩(wěn)，而有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖能明顯提高脾臟指數(shù)（P＜0.05）。因此，可以推斷，有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖治療可以有效減緩肺癌小鼠免疫器官免疫調(diào)節(jié)作用的退化。

CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞分別作用于協(xié)助體液免疫、細(xì)胞免疫功能和抑制免疫應(yīng)答，CD4+/CD8+比例變化反映著T淋巴細(xì)胞亞群水平的變化。因此，由于腫瘤細(xì)胞分泌其他因子，使得腫瘤患者T細(xì)胞亞群數(shù)量和原始CD4+/CD8+比值降低，進(jìn)而引起機(jī)體免疫反應(yīng)紊亂或免疫功能下降[33]。在本研究中，有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黃芪多糖高劑量組和低劑量組顯著增加CD4+水平分別高于黃芪多糖高低劑量組，黃芪多糖可改善CD4+/CD8+的失衡，反映了黃芪多糖對(duì)免疫抑制因子的調(diào)節(jié)作用，而有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖對(duì)CD4+/CD8+的組合調(diào)節(jié)作用更為明顯。

綜上所述，有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖治療可以有效減緩肺癌小鼠免疫器官免疫調(diào)節(jié)作用的退化，在小鼠Lewis肺癌免疫調(diào)節(jié)方面有一定的治療效益。這一研究為臨床有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合黃芪多糖應(yīng)用于腫瘤治療提供了有效依據(jù)。