段曉星 常永麗 張國光 潘雪

010050 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科

糖尿病腎病是糖尿病常見的并發(fā)癥，其病情發(fā)展過程中可導(dǎo)致主動脈鈣化，主動脈鈣化不僅會影響血管內(nèi)皮功能，還會增加心血管并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險[1]。目前臨床上針對糖尿病腎病主動脈鈣化患者主要采用鈣模擬劑、磷結(jié)合劑、活性維生素D等進行治療，但是療效不佳[2]。有研究指出[3]，在糖尿病腎病大鼠中給予大黃酸干預(yù)不僅腎功能指標(biāo)能夠顯著改善，且血鈣、血磷水平和鈣磷乘積均顯著改善，推測該藥物能夠保護糖尿病腎病患者的腎功能，可用于治療糖尿病腎病主動脈鈣化，但其具體治療作用及機制仍需進一步研究。另有研究發(fā)現(xiàn)，人跨膜受體蛋白Notch-1通路(Notch1-recombining binding protein suppressor of hairless，Notch1-RBP-Jk)/相互作用蛋白Msx2(Msx2-interacting nuclear target protein，Msx2)信號通路是經(jīng)典的主動脈鈣化調(diào)控路徑[4]。本研究特進行大鼠實驗探討大黃酸對Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路是否具有調(diào)控作用以及其對糖尿病腎病主動脈鈣化的影響，以期為此類疾病的臨床治療和藥物研發(fā)提供新的思路。

材料與方法

一、實驗材料

40只成年SD大鼠，均購自北京醫(yī)學(xué)實驗動物中心(動物合格證號：SCXK(京)2018-012)，6～8周齡，雄性，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，平均體質(zhì)量(196.8±5.1)g。

大黃酸購自廣州佳科生物科技有限公司(純度95%)；維生素D3注射液購自浙江仙琚制藥股份有限公司；尼古丁購自Merck公司(純度>95%)；24 h尿蛋白比濁法檢測試劑盒、血肌酐酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、血尿素氮電極法檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、組織鈣含量定量檢測熒光試劑盒、總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自上海信帆生物科技有限公司；Von Kossa染料購自美國Sigma公司；一抗、二抗(以辣根酶標(biāo)記)均購自武漢博士德公司；引物序列由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成。

AU5800型全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司；DSX500型光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；DYCP-31A型快速電泳儀購自北京六一儀器廠；SCZX/ABI2720型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀購自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

二、方法

1.分組、建模及干預(yù)方法 在40只大鼠中隨機選取32只建立糖尿病腎病主動脈鈣化模型。剩余8只大鼠記為正常對照組，自由飲食和進水。建模方法參照文獻[5]給予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)4周，給予鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液(1%)腹腔注射液，劑量為35 mg/kg；2周后24 h尿蛋白>30 g，尿量>原尿量的50%，則視為造模成功；然后自次日早上9時，給予維生素D3肌肉注射，劑量為300 000 U/kg，并給予25 mg/kg、5 mL/kg尼古丁灌胃，當(dāng)天晚6時再次灌胃。將建模成功的大鼠隨機分為模型對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，后3組分別給予50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg劑量的大黃酸灌胃，其中低劑量為臨床等效劑量、中劑量為臨床等效劑量的2倍，高劑量為臨床等效劑量的4倍。模型對照組和正常對照組均給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)4周。

2.觀察指標(biāo)

(1)腎功能指標(biāo)：分別于干預(yù)前后檢測各組大鼠的腎功能指標(biāo)，包括24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮，利用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、電極法檢測試劑盒和全自動生化分析儀進行檢測。

(2)腹主動脈鈣化特征：處死大鼠，迅速剝離腹主動脈，對主動脈管腔進行徹底沖洗。常規(guī)固定，脫水，透明，包埋，切片，染色觀察。

(3)腹主動脈組織鈣含量：制成腹主動脈勻漿，離心分離，并利用熒光定量檢測試劑盒和熒光分光光度計檢測腹主動脈組織鈣含量，激發(fā)和散發(fā)波長分別為485 nm和520 nm。

(4)腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2 mRNA表達：采用實時PCR(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各組大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-肌動蛋白(α-smooth muscle aorta，α-SMA)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)的信使核糖核酸(mRNA)表達強度。利用試劑盒提取總RNA，然后對RNA進行電泳。反轉(zhuǎn)錄后實施RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性共2 min，95 ℃變性共15 s，60 ℃水浴共60 s，60 ℃退火45 s，共進行40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束后對擴增曲線和溶解曲線進行分析，測得Ct值，以2-ΔΔCt為目的基因的相對表達強度，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參；ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

(5)腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2蛋白表達：采用蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)法。腹主動脈勻漿滅活后提取總蛋白，定量后電泳，封閉孵育(室溫)。1 h后滴加一抗，孵育過夜(4 ℃)，沖洗后滴加二抗，孵育2 h(37 ℃)，再次沖洗。顯色并以純化水終止反應(yīng)，暗室曝光、顯影。拍照并計算蛋白相對表達量。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計量資料多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，組內(nèi)差異比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

32只大鼠中共有30只建模成功，隨機分為模型對照組(8只)、低劑量組(7只)、中劑量組(7只)和高劑量組(8只)，干預(yù)期間分別有1只、1只、1只、0只死亡，正常對照組實驗期間無大鼠死亡。干預(yù)前模型對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平均高于正常對照組(P<0.05)，干預(yù)后正常對照組均無顯著變化(P>0.05)，模型對照組均顯著升高(P<0.05)，3劑量組均顯著降低(P<0.05)，且干預(yù)后3劑量組均高于正常對照組(P<0.05)，均低于模型對照組(P<0.05)，其中高劑量組均低于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，中劑量組均低于低劑量組(P<0.05)。(表1)

二、各組大鼠腹主動脈鈣化情況觀察及腹主動脈組織鈣含量比較

正常對照組大鼠腹主動脈組織未見鈣鹽沉積，其余4組血管內(nèi)膜和中膜彈性纖維間存在較多的、散在點狀沉積棕褐色鈣鹽顆粒。其中模型對照組鈣化特征最為明顯，可見大范圍融合的鈣化斑塊；低劑量組次之，可見部分鈣化斑塊或較大顆粒的鈣鹽；中劑量組稍輕，可見鈣鹽顆粒；高劑量組鈣化特征最輕，鈣鹽顆粒較少，與正常對照組最為接近。(圖1)

表1 干預(yù)前后各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

注：與同組干預(yù)前對比，aP<0.05；與正常對照組對比，bP<0.05；與模型對照組對比，cP<0.05；與低劑量組對比，dP<0.05；與中劑量組對比，eP<0.05

圖1 各組大鼠腹主動脈鈣化情況觀察(×200) A.正常對照組；B.模型對照組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組

各組大鼠腹主動脈組織鈣含量對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，3劑量組均高于正常對照組(P<0.05)，且均低于模型對照組(P<0.05)，高劑量組低于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，中劑量組低于低劑量組(P<0.05)。(表2)

表2 各組大鼠腹主動脈組織鈣含量比較

注：與正常對照組對比，aP<0.05；與模型對照組對比，bP<0.05；與低劑量組對比，cP<0.05；與中劑量組對比，dP<0.05

三、各組大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2 mRNA表達量比較

各組大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA表達對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中3劑量組表達均高于正常對照組(P<0.05)，均低于模型對照組(P<0.05)，高劑量組均低于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，中劑量組均低于低劑量組(P<0.05)，α-SMA mRNA表達情況剛好相反。(表3)

四、各組大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2蛋白表達量比較

各組大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2蛋白表達量對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中3劑量組表達均高于正常對照組(P<0.05)，均低于模型對照組(P<0.05)，高劑量組均低于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，中劑量組均低于低劑量組(P<0.05)，α-SMA蛋白表達情況剛好相反。(圖2、表4)

表3 各組大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2 mRNA表達量比較

注：與正常對照組對比，aP<0.05；與模型對照組對比，bP<0.05；與低劑量組對比，cP<0.05；與中劑量組對比，dP<0.05

表4 各組大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2蛋白表達量比較

注：與正常對照組對比，aP<0.05；與模型對照組對比，bP<0.05；與低劑量組對比，cP<0.05；與中劑量組對比，dP<0.05

圖2 各組大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2蛋白表達量western blot檢測結(jié)果

討 論

糖尿病腎病主動脈鈣化主要是由于血糖長期處于較高水平，導(dǎo)致微血管、神經(jīng)病變等，使得血管彈性降低，血管壁受損，加之隨著年齡的增長血管逐漸老化而形成的[6-8]。主動脈鈣化會使血管僵硬度增加，血管彈性和順應(yīng)性減弱，脈壓增加，左心室負(fù)荷增大，進而可導(dǎo)致左心室肥厚，還可誘發(fā)并逐漸加重冠狀動脈缺血狀態(tài)，誘發(fā)冠心病、心力衰竭等心血管疾病，甚至危及患者的生命安全[9]。有研究表明[10]，主動脈鈣化的常見危險因素有糖尿病腎病、鈣磷代謝紊亂、年齡增長和透析齡增加，目前仍缺乏行之有效的治療方案，因此探討糖尿病主動脈鈣化的理想控制方案及其治療作用機制，符合臨床患者的迫切需求。

本次研究顯示，與正常對照組相比較，模型對照組24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮均升高，3劑量組也均升高，且3劑量組指標(biāo)水平均低于模型對照組，表明對糖尿病腎病鈣化大鼠模型給予大黃酸干預(yù)能夠發(fā)揮保護腎臟的作用；其中，高劑量組的效果最佳，表明該藥物的腎保護作用呈劑量依賴性。此外，模型對照組大鼠腹主動脈鈣化較嚴(yán)重，而3劑量組均明顯減輕，且高劑量組鈣化情況最輕，可知大黃酸能夠減輕糖尿病腎病鈣化大鼠模型的腹主動脈鈣化情況，且高劑量大黃酸的效果更佳，關(guān)于腹主動脈組織鈣含量的檢測結(jié)果也證實了此結(jié)論。大黃酸是從大黃干燥的根莖中提取的有效成分，而大黃具有利濕退黃、清熱瀉火、涼血解毒的功效[11]。大黃酸也被證實能夠延緩糖尿病腎病的發(fā)展進程，保護腎功能[12]。大黃酸能夠控制腎小球系膜細(xì)胞的增殖，控制腎纖維化，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少尿蛋白，因此對糖尿病腎病主動脈鈣化大鼠有良好的保護腎功能的作用[12]。有研究顯示[13]，大黃酸能夠預(yù)防心血管并發(fā)癥，推測與其能夠控制氧化應(yīng)激并減輕血管壁損傷有關(guān)。但是關(guān)于大黃酸對糖尿病腎病主動脈鈣化的作用機制仍需要進一步探討。

本次研究顯示，與正常對照組相比較，模型對照組Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA表達和蛋白相對表達量均顯著升高，且3劑量組均明顯高于正常對照組，低于模型對照組，3劑量組間相比較，低劑量組Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA和蛋白相對表達量均最高，中劑量組均次之，高劑量組均最低，α-SMA mRNA及蛋白表達情況相反，可知大黃酸能夠調(diào)節(jié)糖尿病腎病主動脈鈣化大鼠腹主動脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2 mRNA及蛋白的表達水平。Notch1-RBP-JK/Msx2是經(jīng)典的主動脈鈣化信號傳導(dǎo)調(diào)控通路，在此通路上，Notch1能夠正向調(diào)控RBP-JK和Msx2，且α-SMA、Runx2的表達均受該信號通路的調(diào)控[14-16]，當(dāng)該信號通路受到刺激被激活，Notch1、RBP-JK、Msx2表達增強，其下游的α-SMA也可被激活，而Runx2則可受到抑制，參與主動脈鈣化病變過程。在高磷、高糖的環(huán)境下和炎癥因子的刺激作用下，Notch1、RBP-JK、Msx2等成骨轉(zhuǎn)錄因子的基因和蛋白的表達均活化，進而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成骨細(xì)胞，并刺激礦化的發(fā)生。Msx2被認(rèn)為是主動脈鈣化的關(guān)鍵調(diào)控因子，已經(jīng)被確認(rèn)屬于成骨分化和礦化的同源轉(zhuǎn)錄因子[17]。在此信號通路傳導(dǎo)過程中，α-SMA、Runx2等成骨因子均積極參與，其中α-SMA屬于平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物，其表達水平降低意味著血管平滑肌功能受損[18]；Runx2具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在前成骨細(xì)胞、前軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和前肥大軟骨細(xì)胞中表達，能夠促進成骨轉(zhuǎn)化和骨形成[19]。有報道顯示，在糖尿病腎病主動脈鈣化發(fā)生和發(fā)展的過程中，Notch1-RBP-JK/Msx2信號通路參與其中并發(fā)揮極大的作用，影響病情發(fā)展[20]。結(jié)合本研究結(jié)果推測大黃酸能夠下調(diào)Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA及蛋白表達，上調(diào)α-SMA mRNA及蛋白表達，從而發(fā)揮減輕糖尿病腎病主動脈鈣化。但是關(guān)于大黃酸對上述基因和蛋白的具體調(diào)控機制尚未見相關(guān)報道，仍需深入探討。

綜上所述，大黃酸能夠保護糖尿病腎病主動脈鈣化大鼠的腎功能，減輕主動脈鈣化，減少主動脈組織的鈣含量，推測其作用機制與下調(diào)Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA及蛋白表達，上調(diào)α-SMA mRNA及蛋白表達有關(guān)。本研究為糖尿病腎病主動脈鈣化的治療藥物研究提供了新的方向，顯示出良好的研究價值和發(fā)展前景，而該藥物對上述基因和蛋白表達的具體調(diào)控機制仍需要進一步研究。