寇曦曦

臨床上肝毒性評價(jià)方面主要依賴超微病理學(xué)、臨床生化指標(biāo)(如總膽汁酸、血清轉(zhuǎn)氨酶等)、活性代謝產(chǎn)物、組織病理學(xué)、免疫相關(guān)指標(biāo)，但這類指標(biāo)穩(wěn)定性、靈敏性、特異性較差，無法為其提供早期確切信息[1]。近幾年，有報(bào)道顯示肝特異性mRNA-122(microRNA-122，miR-122)調(diào)控肝細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、代謝、應(yīng)激等過程，相較于傳統(tǒng)肝毒性評價(jià)指標(biāo)，其能準(zhǔn)確區(qū)分肝外損傷與肝損傷；與組織病理學(xué)結(jié)果具有明顯相關(guān)性，有望成為早期藥物肝毒性評價(jià)的生物標(biāo)志物[2]。但目前鮮有關(guān)于miR-122評價(jià)藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)患者早期藥物肝毒性的報(bào)道，故本文開展相關(guān)研究，旨在為DILI防治提供參考依據(jù)，報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

納入2016年4月至2019年4月于我院收治的84例DILI患者為對象，獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《藥物性肝損傷診治指南》[3]，均經(jīng)肝穿病理確診為急性藥物性肝損傷，排除其他病因所致肝損傷；存在與藥物性肝損傷發(fā)病規(guī)律一致的潛伏期；停藥后異常肝臟指標(biāo)迅速恢復(fù)；再次用藥反應(yīng)呈陽性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲，首次發(fā)??；(2)均于用藥1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)肝功能損害，白細(xì)胞增加，伴發(fā)熱、皮疹、黃疸、瘙癢等初發(fā)癥狀；(3)藥物淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)呈陽性；(4)偶然用藥后再次出現(xiàn)；(5)抗丙型肝炎病毒抗體、乙肝表面抗原、抗人類免疫缺陷病毒抗體檢測結(jié)果均呈陰性；(6)知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有過量飲酒史；(2)伴自身免疫性肝炎、脂肪性肝炎、腦出血、病毒性肝炎、酒精性肝炎及其他嚴(yán)重肝臟疾病；(3)伴心、腦、腎、肺等嚴(yán)重臟器功能障礙及精神疾患者；(4)肝癌及其他惡性腫瘤。將納入的84例DILI患者設(shè)為觀察組，另選取同期入選的90例健康體檢者為正常對照組，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較[(±s)，n(%)]

二、 方法

(一)miR-122檢測 采用Trizol試劑盒 (日本Takara公司)提取血清中總RNA，應(yīng)用Nanodrop ND-1 000分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)，以分光光度法行總RNA濃度和純度檢測。采用Prime-Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)miR-122，逆轉(zhuǎn)錄試劑包括樣本RNA 1μg、DEPC水13 μL、Bulge-loop RT Primer 2 μL、反轉(zhuǎn)錄酶5×Prime-script RT Enzyme Mix 2 μL、反應(yīng)緩沖液5×Primescript Buffer 4 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃60min，70℃10min。將miR-122逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后置于-20℃保存。內(nèi)參基因取U6，采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(熒光定量PCR儀Step one plus，美國Applied Biosystems公司生產(chǎn))測定U6、血清miR-122。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，SYBR Green solution 10 μL，上下游引物均為0.4 μL，去離子H2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性2 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，循環(huán)40次，軟件分析Ct值。引物由美國SBI公司合成。采用公式2-△△Ct，對miR-122在DILI中的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，ΔCt=miR-122Ct-U6Ct。

(二)肝功能指標(biāo)檢測 采用HITA-CHI-7080型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立產(chǎn)業(yè)株式會社生產(chǎn))及相配套試劑，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酸(aspartate transaminase，AST)。

三、 觀察指標(biāo)

觀察兩組miR-122表達(dá)及肝功能指標(biāo)TBil、AST、ALT、ALP水平，分析miR-122表達(dá)與上述肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、 兩組miR-122表達(dá)及ALT、TBil、ALP、AST水平比較

觀察組miR-122表達(dá)及ALT、TBil、ALP、AST水平均顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

二、 DILI患者血清miR-122表達(dá)與ALT、TBil、ALP、AST的相關(guān)性分

經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，DILI患者血清miR-122表達(dá)與ALT、AST水平呈線性正相關(guān)(r=0.662、0.698，P=0.000、0.000)，與TBil、ALP水平呈線性正相關(guān)(r=0.732、0.624，P=0.000、0.000)，見圖1～4。

表2 兩組miR-122表達(dá)及ALT、TBil、ALP、AST水平比較(±s)

圖1 miR-122與ALT的線性相關(guān)圖

圖2 miR-122與TBil的線性相關(guān)圖

圖3 miR-122與ALP的線性相關(guān)圖

圖4 miR-122與AST的線性相關(guān)圖

討 論

miR-122處于人類基因組第18號染色體，屬內(nèi)源性小分子單鏈RNA，可經(jīng)調(diào)節(jié)其作用靶基因調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。目前臨床證實(shí)肝特異性表達(dá)的miR-122在肝組織中呈高度表達(dá)，表達(dá)量為肝中miRNAs的70%以上，在其他組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)[4-5]。古巧燕等[6]采用乙酰氨基苯酚灌胃法建立急性藥物性肝損傷動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)模型組灌胃8、16、24 h時(shí)血清miR-122水平較對照組有顯著差異，且與ALT、AST水平呈正相關(guān)，與ALP、TBil水平無明顯相關(guān)性(可能與動(dòng)物模型病理損傷部位有關(guān))，推測急性藥物性肝損傷血清miR-122水平升高預(yù)示肝細(xì)胞損傷加重。

本研究結(jié)果顯示，觀察組miR-122表達(dá)及ALT、TBil、ALP、AST水平均明顯高于對照組，而直線相關(guān)分析顯示DILI患者血清miR-122表達(dá)與上述肝功能指標(biāo)均呈線性正相關(guān)，推測miR-122可能參與DILI發(fā)病過程，筆者推測，可能與miR-122特性有關(guān)，miR-122主要經(jīng)與編碼區(qū)堿基和靶mRNA 3’-或 5’-非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對，對靶mRNA穩(wěn)定性進(jìn)行調(diào)整，轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因表達(dá)起著調(diào)控作用。而miR-122水平改變往往早于蛋白水平，可經(jīng)組織細(xì)胞損傷致其被動(dòng)漏出方式，或經(jīng)微泡分泌后以RNA結(jié)合蛋白形式進(jìn)入血液循環(huán)。發(fā)生藥物性肝損傷時(shí)，血清miR-122表達(dá)顯著升高，與肝組織病理學(xué)變化程度和血清ALT、TBil、ALP、AST存在明顯相關(guān)性，與其檢測方法(實(shí)時(shí)定量PCR)的高特異性、高敏感性也有關(guān)。也有報(bào)道認(rèn)為循環(huán)中miR-122表達(dá)水平明顯上調(diào)，推測組織損傷時(shí)其與循環(huán)中AST、ALT類似，由受損組織細(xì)胞分泌而來，能更好反映肝細(xì)胞損傷程度[7]。

綜上，血清miR-122在DILI患者早期藥物肝毒性評價(jià)中具有重要價(jià)值，臨床應(yīng)引起足夠重視。但因樣本量偏小，未涉及其他種類的miRNAs，并未探討不同DILI病理類型、嚴(yán)重程度與血清miR-122的關(guān)系，故今后有待進(jìn)一步深入調(diào)查研究。