■蔣 慧 程林麗

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193)

雷瑣酸內(nèi)酯類藥物屬于同化激素中的非甾類雌性激素，主要包括α-玉米赤霉醇（ZER）、β-玉米赤霉醇(β- ZAL)、玉米赤霉烯酮(ZON）、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)和玉米赤霉酮(ZAN）[1]。具有抗菌、抗瘧疾等作用[2]，能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、增重、提高瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率[3]，但同時(shí)也有致癌、致畸、致突變以及其它潛在的健康安全隱患。目前許多國家已禁止使用該類藥物促進(jìn)家畜的生長，我國的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告中對(duì)于玉米赤霉醇的使用也有了明確規(guī)定[4]，但由于其經(jīng)濟(jì)回報(bào)高，違法使用的現(xiàn)象仍然存在，除此之外飼料霉變也可能導(dǎo)致該類藥物的產(chǎn)生。

我國有關(guān)飼料中雷瑣酸內(nèi)酯類藥物的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)主要有3個(gè)，其中農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告—6-2010規(guī)定了飼料中雷瑣酸內(nèi)酯類藥物的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法，檢測限與定量限分別為2 μg/kg 和5 μg/kg[5]。GB/T 19540—2004 規(guī)定了玉米赤霉烯酮的薄層色譜測定方法和酶聯(lián)免疫吸附測定法，最低檢測量分別為為20 μg/kg 和0.25 μg/kg[6]。GB/T 28716—2012 規(guī)定了飼料中玉米赤霉烯酮含量的免疫親和柱凈化高效液相色譜的測定方法，檢測限與定量限分別為2 μg/kg和10 μg/kg[7]。

由于雷瑣酸內(nèi)酯類藥物與一些其他真菌毒素及藥物等結(jié)構(gòu)相似且在飼料中的含量有可能較低，為了從源頭上解決雷瑣酸內(nèi)酯類藥物的殘留，對(duì)飼料品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，需要采用高準(zhǔn)確度和精密度的定性定量方法。而氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)方法正是生物樣品及飼料中雷瑣酸內(nèi)酯類藥物高準(zhǔn)確度和精密度檢測的經(jīng)典測定方法之一。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Shimadzu GC-2010 Plus 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS），配電子轟擊離子源(EI)，日本Shimadzu 公司；MP2002 型電子天平（感量0.01 g），上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；FA1204C 精密電子分析天平（感量0.000 01 g），上海越平科學(xué)儀器有限公司；Sep-Pak SiLica 固相萃取裝置，美國Waters 公司；HQ-60-II 渦旋混合器，北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；SHK-99-Ⅱ臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床，北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；TARGIN?VX-Ⅲ多管渦旋震蕩器，北京踏錦科技有限公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)（可達(dá)8 000 r/min，相對(duì)離心力為7 012 g），德國Eppen?dorf 公司；DGF25012CN 電熱恒溫干燥箱，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；N-Evap112 氮吹儀，美國Or?ganomationAssociates 公司；MiLLi-Q 超純水系統(tǒng)，美國MiLLipore 公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品

α-玉米赤霉醇；β-玉米赤霉醇；玉米赤霉酮；α-玉米赤霉烯醇；β-玉米赤霉烯醇；玉米赤霉烯酮，純度均≥99%，均來自美國Sigma公司。

1.2.2 試劑

甲醇、乙腈、甲酸色譜純，水為符合GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

甲醇-水（80+20，v/v）：用量筒分別量取80 ml 甲醇和20 ml水，置于同一玻璃瓶內(nèi)，搖勻。

乙腈-水（10+90，v/v）：用量筒分別量取10 ml 乙腈和90 ml水，置于同一玻璃瓶內(nèi)，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液(100 μg/ml)：用精密電子分析天平分別稱取六種雷瑣酸內(nèi)酯類藥物各0.01 g（精確到0.000 01 g），并置于100 ml 容量瓶，向其內(nèi)加入甲醇進(jìn)行溶解稀釋定容。-20 ℃冰箱中保存3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1 μg/ml)：取100 μg/ml 雷瑣酸內(nèi)酯類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 ml于100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋定容，4 ℃冰箱中保存1個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量1 μg/ml 六種雷瑣酸內(nèi)酯類藥物混合后的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用乙腈稀釋成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μg/ml和1 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。4 ℃冰箱中保存1周。

1.3.2 采樣和試樣制備

按照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，取飼料樣品，采用四分法縮減取約200 g，粉碎后過0.45 mm 孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中，備用。用于后續(xù)的藥物提取以及藥物添加回收試驗(yàn)。

1.3.3 樣品處理

1.3.3.1 提取

稱取5 g 飼料于50 ml 離心管中，加15 ml 甲醇-水（80+20，v/v），蓋好管蓋后可將多個(gè)離心管一起置于試管架上以同時(shí)在多管渦旋震蕩器上渦旋1 min，之后將試管及試管架一起固定在臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床上震蕩40 min。8 000 r/min 離心10 min，將上層的提取液快速倒入另一50 ml離心管中，再取15 ml甲醇-水（80+20，v/v）于下層飼料殘?jiān)诘碾x心管中，重復(fù)震蕩，離心等步驟，之后合并兩次提取液，定容至30 ml，混勻備用。

1.3.3.2 凈化

從上一步驟所得的混合提取液中取3 ml 溶液于10 ml離心管中。加3 ml正己烷，渦動(dòng)1 min，6 000 r/min離心1 min，之后倒掉上清液。下層用3 ml 正己烷重復(fù)洗滌一次。50 ℃水浴中用氮?dú)獯抵? ml 左右，加入2 ml水充分溶解殘液，為上樣溶液。取固相萃取裝置，將6 cc/500 mg HLB固相萃取柱安裝于其上，依次用5 ml 乙腈和5 ml 水預(yù)洗，取3 ml 上樣溶液過柱。之后依次用乙腈-水（10+90，v/v）和水各5 ml 進(jìn)行淋洗。待溶液全部滴下后抽真空1 min。再用含6%的甲酸乙腈10 ml 洗脫，待溶液全部滴下后抽真空1 min，將洗脫液收集到試管中。50 ℃氮?dú)獯蹈桑ó?dāng)溶液剩下2 ml左右時(shí)，取出，渦動(dòng)10 s，待殘留于試管上方管壁的藥物重新溶解于溶液中后接著氮吹至干），供衍生化用。同時(shí)取500 μl 標(biāo)準(zhǔn)工作液于試管中，50 ℃氮?dú)獯蹈?，供衍生化用，作為?duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

上樣溶液和洗脫液的流速均控制在1 ml/min 以內(nèi)。衍生化之前的氮吹過程中一定要盡可能地吹得足夠干，以免影響衍生化效果。

1.3.3.3 衍生化

加衍生化試劑200 μl，渦動(dòng)溶解，封口膜密封，60 ℃恒溫箱中衍生化15 min，冷卻至室溫后加入300 μl小襯管中供氣相色譜-質(zhì)譜測定。樣品溶液中藥物濃度超過檢測范圍時(shí)用甲苯稀釋后進(jìn)樣。

1.3.4 測定

1.3.4.1 色譜參考條件

氣相色譜柱：Rtx-5MS，長度：30 m，膜厚：0.25 μm，內(nèi)徑：0.25 mm?；駾B-5MS 柱等相當(dāng)者。載氣：氦氣，載氣流速：1.0 ml/min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃。進(jìn)樣量：1 μl，不分流。柱溫程序：起始120 ℃，以15 ℃/min的速度升至280 ℃，保持5.2 min。

1.3.4.2 質(zhì)譜參考條件

電子轟擊電離(EI)。電離能量：70 eV。接口溫度：280 ℃。離子源溫度：230 ℃。溶劑延遲：7 min。采集方式：選擇離子檢測（SIM）。開始時(shí)間：7 min，結(jié)束時(shí)間：15.9 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的飼料及生物樣品中雷瑣酸內(nèi)酯類藥物檢測方法的提取劑主要有甲醇、乙酸、乙酸乙酯、甲醇-水（80+20，v/v）、乙腈-水（84+16，v/v）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，這些提取溶劑均具有很好的提取效果，但甲醇對(duì)少數(shù)預(yù)混合飼料中的藥物提取率低，乙腈-水（體積比84:16）對(duì)某些配合飼料中的藥物提取率低，甲醇-水（體積比80:20）做提取溶劑時(shí)的飼料適用范圍最廣，對(duì)供試飼料基質(zhì)中藥物的提取效率均超過了90%，因此最后確定使用它作為提取溶劑。

2.2 提取方法的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)提取方法主要為渦旋震蕩和/或超聲之后過濾或離心的方法。

農(nóng)業(yè)部1486 號(hào)公告—6-2010 標(biāo)準(zhǔn)方法簡單的采取渦動(dòng)1 min 和3 600 r/min 離心5 min 的方法，經(jīng)過兩次提取，藥物提取率相對(duì)較低。再此方法的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采取渦動(dòng)1 min 后采用臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床震蕩40 min的方法，并提取兩次。

2.3 凈化方法的選擇

農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告—6-2010標(biāo)準(zhǔn)方法要經(jīng)過兩次液液分配、多次氮?dú)獯蹈?、外加固相萃取小柱凈化過程。整個(gè)凈化過程繁瑣，耗時(shí)長，樣品前處理過程過于復(fù)雜，不利于我國飼料監(jiān)控過程中的時(shí)效要求。在該方法的基礎(chǔ)上，我們將HLB 小柱從60 mg 換成500 mg，經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化過柱條件，大大地提高了小柱的凈化效果。因此減除了乙醚-0.1%碳酸鈉洗滌和多次濃縮置換溶劑的步驟，大大地簡化了凈化步驟，將工作量縮減了三分之二，樣品前處理時(shí)間縮短了一半。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)六種藥物的分子結(jié)構(gòu)特征，采取選擇離子檢測模式，參考農(nóng)業(yè)部1486 號(hào)公告—6-2010 的儀器分析條件，對(duì)六種雷瑣酸內(nèi)酯類藥物進(jìn)行測定。采用Rtx-5MS 毛細(xì)管柱代替原來的DB-5MS 分離柱。載氣流速為1 ml/min，進(jìn)樣口溫度280 ℃，爐溫初始120 ℃，以15 ℃/min 的速率升至280 ℃，并在此溫度下保持5.2 min，色譜時(shí)間15.9 min。由于兩種玉米赤霉烯醇在實(shí)際樣品的檢測過程中發(fā)現(xiàn)，m/z536定量比m/z305定量的抗干擾能力更佳，因此采用前者為定量離子。在此條件下，六種雷瑣酸類酯類藥物分離良好。各化合物的定性定量離子見表1。

表1 雷索酸內(nèi)酯類藥物的定性離子和定量離子(m/z)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在給定儀器條件下，對(duì)0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 μg/ml 和0.5 μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生化后進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的色譜峰峰面積值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得六種雷瑣酸內(nèi)酯類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1，相關(guān)方程和線性相關(guān)系數(shù)見表2。以上結(jié)果表明，在0.001～0.5 μg/ml 范圍內(nèi)，藥物濃度與峰面積呈線性相關(guān)。在進(jìn)行實(shí)際樣品的分析時(shí)，如果分析物的終濃度不在這個(gè)線性范圍，則應(yīng)該將分析物進(jìn)行稀釋或濃縮。

圖1 雷瑣酸類酯類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 方法的靈敏度

在本試驗(yàn)條件下，以外標(biāo)法定量。檢測限以空白樣品中與標(biāo)準(zhǔn)品藥物保留時(shí)間相同位置的基線噪聲的3倍值為依據(jù)，定量限以空白樣品在標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的基線噪聲的10 倍值為依據(jù)，測得配合飼料中六種雷瑣酸內(nèi)酯類化合物的檢測限均為2.0 ng/g，定量限均為5.0 ng/g，能夠滿足飼料中雷瑣酸內(nèi)酯類藥物的分析需要。

對(duì)配合飼料進(jìn)行5.0 ng/g 的空白添加回收試驗(yàn)，往空白飼料中添加相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，渦動(dòng)，混勻，使飼料中各化合物的藥物濃度為5.0 ng/g。靜置15 min 以上，按樣品前處理過程進(jìn)行提取和凈化，衍生化，之后采用氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。各化合物的回收率水平在71%～91%之間，變異系數(shù)在1.69%～9.73%之間。該結(jié)果表明，定量限添加水平的準(zhǔn)確度和精密度均滿足痕量分析方法的要求。

表2 雷索酸類酯類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

表3 5.0 ng/g雷索酸類酯類藥物的空白添加回收結(jié)果（n=3）

2.7 方法的準(zhǔn)確度和精密度

為考察方法的精密度、準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)以及其適用范圍，對(duì)配合飼料進(jìn)行空白添加回收試驗(yàn)。稱取5 g 空白飼料，往其內(nèi)添加相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，對(duì)六種藥物設(shè)0.01、0.1、2.0 μg/g 三個(gè)添加水平。每個(gè)水平設(shè)4 個(gè)重復(fù)。渦動(dòng)，混勻，靜置15 min以上，按樣品前處理過程進(jìn)行提取和凈化，經(jīng)衍生化后采用氣相色譜質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。添加回收結(jié)果如表4 所示。在這些不同的飼料和不同的藥物添加水平上，各個(gè)藥物的添加回收率范圍均在80%～94%之間，變異系數(shù)均小于12%。由此結(jié)果可知，對(duì)飼料中此六個(gè)化合物分析的準(zhǔn)確度和精密度均符合飼料中污染物檢測和飼料藥物添加劑檢測的方法要求。

3 討論

本試驗(yàn)在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過對(duì)提取溶劑、提取條件、凈化方法、以及儀器檢測條件的選擇與調(diào)整，對(duì)飼料中雷瑣酸內(nèi)酯類藥物的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化。采用甲醇-水（80+20，v/v）為提取液，正己烷除脂（正己烷萃取，然后除去正己烷層，可以幫助除去脂類而不影響目標(biāo)物回收）和6cc/500 mg HLB固相萃取柱凈化，經(jīng)過衍生化試劑BSTFA+TMCS(99+1)衍生化，之后采用氣相色譜質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。該方法的準(zhǔn)確性、精密度和靈敏度均達(dá)到我國對(duì)飼料中雷瑣酸內(nèi)酯類藥物檢測的要求。與農(nóng)業(yè)部1486 號(hào)公告—6-2010 方法比較減少了操作步驟和溶劑的使用，大大節(jié)約了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。與農(nóng)業(yè)部1486 號(hào)公告—6-2010 方法的詳細(xì)比較見表5。

表4 添加回收率和變異系數(shù)（n=4）

表5 本方法與農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告—6-2010方法的對(duì)照

4 結(jié)論

該檢測方法，對(duì)六種雷瑣酸內(nèi)酯類藥物檢測限均為2.0 μg/kg，定量限均為5.0 μg/kg，在0.01、0.1、2.0 μg/g 添加水平下，平均回收率為80%～94%之間，變異系數(shù)均小于12%，能夠滿足飼料中雷瑣酸內(nèi)酯類藥物的分析需要。且與農(nóng)業(yè)部1486 號(hào)公告—6-2010方法比較實(shí)驗(yàn)流程更方便快速，更適合大批量日常分析檢測。