嚴(yán)曉偉，劉 坤，胡皆樂(lè)，姜松耀，項(xiàng) 明

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院普外科，上海 201801；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院外科，上海 200025）

胃癌在全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤中列第5位。在我國(guó)，胃癌在癌癥死亡率列第3位[1]，并呈年輕化趨勢(shì)。目前對(duì)胃癌采用以手術(shù)為主的綜合治療模式，其中單純手術(shù)治療的胃癌病人總體生存率僅為20%～40%。根治性手術(shù)切除是現(xiàn)今唯一可治愈胃癌的方法[2]。準(zhǔn)確評(píng)估病人分期及腫瘤狀態(tài)，監(jiān)測(cè)治療過(guò)程并及時(shí)調(diào)整治療方案，是提高胃癌病人總體生存率的一個(gè)途徑。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）的檢測(cè)是當(dāng)下受關(guān)注較多的非侵入性液體活檢方法,可用來(lái)預(yù)測(cè)預(yù)后、評(píng)估分期、監(jiān)測(cè)療效[3]，具有一定的臨床意義。

資料與方法

研究上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院2016年1月至2017年12月所有進(jìn)展期胃癌根治性手術(shù)的病人。病人同時(shí)進(jìn)行CTC檢查。并由同一組手術(shù)醫(yī)師完成手術(shù)，同一組病理科醫(yī)師完成病理學(xué)檢查。不包括如下：①術(shù)前行新輔助治療后行根治手術(shù)；②術(shù)后因并發(fā)癥發(fā)生再次手術(shù)的病人；③術(shù)后病理檢查結(jié)果為非腺癌的其他腫瘤類型。

一、研究方法

（一）CTC 檢測(cè)

病人行術(shù)前CTC檢測(cè)。方法及試劑為廣州益善公司提供。采用納米技術(shù)結(jié)合多重RNA原位分析技術(shù)檢測(cè)，其CTC截留率＞80%，特異度＞90%。通過(guò)納米過(guò)濾截留CTC，行細(xì)胞分離，然后行多重RNA原位分析、10個(gè)熒光通道顯影，對(duì)各亞型進(jìn)行分型。CTC檢測(cè)包括CTC分離和分型鑒定兩個(gè)部分。在CTC分離部分，抽取5 mL外周血后，首先使用紅細(xì)胞裂解液裂解外周血中的紅細(xì)胞，然后使用8 μm 直徑的過(guò)濾膜（Millipore,Billerica,MA,USA）截留CTC。原位雜交前，先使用蛋白酶（Qiagen，Hilden,Germany）處理過(guò)濾膜上富集的CTC，然后在42℃行原位雜交2 h。使用RNA探針捕獲上皮型標(biāo)志物 EpCAM、CK8、CK18、CK19，間質(zhì)型標(biāo)志物Twist、Vimenti以及白細(xì)胞標(biāo)志物CD45。然后使用洗脫液（Sigma,St Louis,USA）對(duì)無(wú)探針標(biāo)記的細(xì)胞洗脫3次。使用30%馬血清（Sigma,St Louis,USA）、1.5%十二烷基硫酸鈉（Sigma,St Louis,USA）和3 mM Tris-HCl溶液（pH 8.0）（Sigma,St Louis,USA）在 42 ℃對(duì)標(biāo)本進(jìn)行保溫?cái)U(kuò)增20 min。待過(guò)濾膜冷卻后，重新使用洗脫液洗脫3次，之后再次進(jìn)行保溫?cái)U(kuò)增。預(yù)先標(biāo)記針對(duì)上皮型標(biāo)志物EpCAM、CK8、CK18、CK19的熒光染料Alexa Fluor594，針對(duì)間質(zhì)型標(biāo)志物 Twist、Vimenti的熒光染料 Alexa Fluor488和針對(duì)白細(xì)胞標(biāo)志物CD45的熒光染料Alexa Fluor647，將3種熒光標(biāo)記的探針加入過(guò)濾膜中，繼續(xù)在42℃保溫20 min。再次使用洗脫液洗脫后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma,St Louis,USA）將過(guò)濾膜上的CTC進(jìn)行熒光染色5 min，然后使用熒光顯微鏡進(jìn)行分析 （Olympus BX53,Tokyo,Japan）（見(jiàn)圖 1）。

（二）病理檢查

完成病理檢查，病理報(bào)告包括腫瘤的病理類型、分化程度、神經(jīng)及脈管累及情況、腫瘤浸潤(rùn)深度，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況。

（三）CTC檢測(cè)與病理分期

分析CTC檢測(cè)結(jié)果與病理分期[T（腫瘤浸潤(rùn)深度）、N（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）、M（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）]的關(guān)系。

（四）隨訪

術(shù)后2年內(nèi)，每3個(gè)月檢查血常規(guī)、肝腎功能和 CEA、CA 199、CA125；每 6個(gè)月作胸、腹部 CT及胃鏡檢查，電話和門診結(jié)合隨訪。隨訪終點(diǎn)為腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或失訪。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理和分析。計(jì)數(shù)資料采用百分比，計(jì)量資料采用均數(shù)和95%可信區(qū)間。采用Spearman′s rho相關(guān)性分析。

結(jié) 果

一、一般資料

收集我院符合標(biāo)準(zhǔn)病例共30例，男18例，女12 例，平均年齡（60.4±8.1）歲。

二、CTC結(jié)果與病理TNM分期

30例病例均完成術(shù)前CTC檢測(cè)及術(shù)后病理檢查。包括CTC總數(shù)及其亞型（間質(zhì)型、上皮型和混合型）檢測(cè)。CTC陽(yáng)性病例共25例，整體陽(yáng)性率為83.3%。上皮型和混合型CTC陽(yáng)性病例所占比例較低，分別為 20%（6/30）和 30%（9/30）。更具侵襲力的間質(zhì)型CTC整體陽(yáng)性率較高，為56.6%（17/30），其中Ⅰ期病例中1例兼具兩型,Ⅱ期病例中2例兼具兩型，1例兼具三型，Ⅲ期病例中2例兼具兩型。術(shù)后病理 TNM分期顯示Ⅰ期 3例 （2例 T1N0、1例T2N0）、Ⅱ期 7 例（2 例 T1、4 例 T2、1 例 T3，1 例 N0、6 例N1），Ⅲ期 20 例（3 例 T2、15 例 T3、2 例 T4，8 例 N1、8 例N2、4例 N3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病理分期越晚，CTC 的陽(yáng)性率及間質(zhì)型CTC陽(yáng)性率越高（見(jiàn)表1）。

Spearman′s rho相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CTC總數(shù)與T分期無(wú)相關(guān)性（P=0.559），但與淋巴結(jié)陽(yáng)性率有相關(guān)性（P=0.038）（見(jiàn)圖 2）；間質(zhì)型 CTC 數(shù)量與 N 分期和TNM分期有相關(guān)性（P=0.040、0.042）。結(jié)果表明，CTC數(shù)量，特別是間質(zhì)型CTC數(shù)量與淋巴結(jié)陽(yáng)性率呈正相關(guān)（見(jiàn)表2）。因混合型為上皮型和間質(zhì)型復(fù)合形成，但各自所占比例不一，如間質(zhì)型占優(yōu)的混合型傾向于間質(zhì)型，反之上皮型占優(yōu)的混合型傾向于上皮型，所以沒(méi)有可比性，本研究不作比較。

圖1 免疫熒光顯微鏡下通過(guò)納米技術(shù)和多重mRNA原位分析技術(shù)得到的圖像

圖2 CTC總數(shù)與淋巴結(jié)陽(yáng)性率的關(guān)系

討 論

CTC是指由實(shí)體惡性腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放入血液循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞，是惡性腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的重要途徑[4]。有研究表明，進(jìn)展期胃癌病人術(shù)前CTC檢測(cè)及亞型分類與腫瘤分期有顯著相關(guān)性[5]。Okabe等[6]研究指出CTC在胃癌轉(zhuǎn)移病人中更常見(jiàn)，根治術(shù)前進(jìn)行CTC檢測(cè)可更好地評(píng)估病人分期。Huang等[7]對(duì)26個(gè)研究進(jìn)行薈萃分析指出，Ⅲ～Ⅳ期胃癌病人與Ⅰ～Ⅱ期相比，CTC陽(yáng)性率差異有顯著性意義。以上研究提示，術(shù)前CTC檢測(cè)可更早發(fā)現(xiàn)可能存在的微轉(zhuǎn)移，是對(duì)TNM中Nx和Mx更精細(xì)分期的補(bǔ)充，更精確地評(píng)估分期。因此，檢測(cè)外周血中的CTC具有重要臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，CTC總數(shù)與T分期和TNM分期無(wú)相關(guān)性，但與淋巴結(jié)陽(yáng)性率有相關(guān)性（P＜0.05）。這可能與CTC進(jìn)行血液淋巴循環(huán)，更易在外周血中檢測(cè)到有關(guān)。因此，CTC總數(shù)與淋巴結(jié)陽(yáng)性率相關(guān)，N分期與淋巴結(jié)陽(yáng)性個(gè)數(shù)有關(guān)。當(dāng)淋巴結(jié)陽(yáng)性數(shù)＞6枚時(shí)都為N3。但N3中淋巴結(jié)陽(yáng)性率并不相同，有些是7枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而有些淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)＞7枚。顯然淋巴結(jié)陽(yáng)性率與CTC數(shù)量更密切相關(guān)，這與本研究的結(jié)果相符（P=0.038）。同時(shí)N分期只是TNM病理分期的一個(gè)因素，因此本研究認(rèn)為CTC總數(shù)與TNM分期無(wú)關(guān)。當(dāng)然本研究樣本量較少，還需更大樣本量的研究進(jìn)一步證實(shí)。

CTC存在不同的亞型，主要有上皮型、間質(zhì)型、混合型等。目前認(rèn)為，細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelialmesenchymal transition,EMT）、腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell,CSC）以及血管生成相關(guān)因子等在CTC中發(fā)揮重要作用[8]。為了長(zhǎng)期存在于血液循環(huán)并保持高度侵襲轉(zhuǎn)移能力，CTC具有CSC特性，而通過(guò)EMT轉(zhuǎn)換使CTC具有侵襲轉(zhuǎn)移的能力，這是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要機(jī)制。因此，對(duì)CTC亞型的檢測(cè)，能更精準(zhǔn)地對(duì)進(jìn)展期胃癌病人進(jìn)行臨床評(píng)估。本研究顯示CTC數(shù)量與病理TNM分期的相關(guān)分析未顯示存在相關(guān)性，但間質(zhì)型CTC的數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、N分期及TNM分期都具有相關(guān)性（P＜0.05）。這也符合間質(zhì)型CTC更具有轉(zhuǎn)移性和侵襲性的特征。

CTC數(shù)量特別是間質(zhì)型CTC的數(shù)量與胃癌的N分期存在相關(guān)性，對(duì)預(yù)測(cè)胃癌分期和臨床預(yù)后是很好的補(bǔ)充，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

表1 各TNM分期的CTC陽(yáng)性率

表2 Spearman’s rho相關(guān)性分析