孫菁, 任文琪, 許勤虎, 曹威*, 劉浩*

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院, 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心, 天津 300457; 2.天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司, 天津 300462)

黑曲霉是一種重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，屬于公認(rèn)安全(generally regarded as safe, GRAS)的食品級(jí)微生物，可利用廉價(jià)的可再生碳源，與其他細(xì)胞工廠相比具有顯著的優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于發(fā)酵生產(chǎn)多種有機(jī)酸和酶制劑[1-3]。通過遺傳代謝工程手段對(duì)黑曲霉菌株開展研究，不僅可以更好地理解其代謝調(diào)控機(jī)制，還可以有目的地進(jìn)行遺傳改造，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，優(yōu)化菌株的發(fā)酵性能。遺傳改造過程中，篩選標(biāo)記基因必不可少。當(dāng)前常被用于黑曲霉遺傳操作的篩選標(biāo)記基因非常有限，如博來霉素抗性基因ble[4]、潮霉素B抗性基因hph[5]、乳清苷酸脫羧酶編碼基因pyrG[6]、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因argB[7]等。復(fù)雜的代謝工程改造往往涉及諸多基因的敲除或表達(dá)，有限的篩選標(biāo)記基因難以滿足需要。

amdS是構(gòu)巢曲霉中乙酰胺酶編碼基因，賦予其可在乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制已被廣泛研究[8-9]。Hynes等[9]發(fā)現(xiàn),黑曲霉因缺乏amdS基因而不能利用乙酰胺作為唯一氮源，因此,amdS可作為黑曲霉轉(zhuǎn)化過程中的篩選標(biāo)記。

在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸過程中，草酸是一種主要的副產(chǎn)物。微生物中草酸的合成途徑主要有兩種：一是乙醛酸代謝中，乙醛酸在乙醛酸氧化酶(EC 1.2.3.5)作用下生成草酸；二是草酰乙酸在草酰乙酸乙酰基水解酶(OAH，EC 3.7.1.1)作用下水解生成草酸和乙酸，而在黑曲霉中只存在草酰乙酸乙?；饷妇幋a基因oahA。在α-淀粉酶生產(chǎn)菌株黑曲霉BO-1中，敲除OAH編碼基因后發(fā)酵液中不再含有副產(chǎn)物草酸[10]。因此，黑曲霉中草酸的生物合成只來源于OAH對(duì)草酰乙酸的水解過程[10-11]。本研究在黑曲霉中成功構(gòu)建了以amdS基因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，賦予其對(duì)乙酰胺的利用能力，為轉(zhuǎn)化子的篩選提供了正向選擇標(biāo)記，并應(yīng)用該篩選標(biāo)記成功獲得黑曲霉oahA敲除菌株，同時(shí)對(duì)其合成草酸水平的變化進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌JM109由天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。黑曲霉ATCC1015(編號(hào)S304)購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。構(gòu)巢曲霉(編號(hào)S478)由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供；質(zhì)粒pLH331為表達(dá)質(zhì)粒(含有l(wèi)oxP-hph-loxP元件及兩側(cè)的多克隆位點(diǎn))用于oahA基因回補(bǔ)菌株構(gòu)建；質(zhì)粒pLH334為構(gòu)建敲除質(zhì)粒出發(fā)載體(含有ble標(biāo)記基因，在loxP-hph-loxP元件兩端含有多克隆位點(diǎn))由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。宿主菌中含有可被多西四環(huán)素誘導(dǎo)的Tet-On系統(tǒng),能夠介導(dǎo)重組酶Cre的表達(dá)。潮霉素B抗性篩選標(biāo)記hph兩側(cè)包含兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，在Cre重組酶的作用下hph從基因組上被切除。

1.1.2主要儀器與試劑 RH-250-A型生化培養(yǎng)箱購(gòu)自韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；HNY-200B型控溫?fù)u床購(gòu)自上海志成設(shè)備廠；1260系列高效液相色譜儀(HPLC)購(gòu)自安捷倫科技有限公司；SCD-II型高純水裝置購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所；TGL-16臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自上海醫(yī)用分析儀器廠；EDC-810型PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；4N75光學(xué)顯微鏡購(gòu)自尼康公司。

限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Phanta Max高保真酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PrimeSTAR HS(Premix)高保真酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，ClonExpress II One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，PCR引物(表1)由華大基因股份有限公司合成。卡那霉素購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，乙酰胺購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 本研究中所用引物

1.1.3培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g·L-1。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加適量蒸餾水煮沸約30 min，紗布過濾，取清液。加入20 g葡萄糖完全溶解，然后加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉15 g·L-1。

真菌生長(zhǎng)完全培養(yǎng)基(CM)：取蒸餾水897 mL加入瓊脂15 g，121 ℃滅菌20 min。依次加入ASP+N 20 mL，CM Trace elements 1 mL，10%酪蛋白水解物10 mL，50%葡萄糖20 mL，10%酵母浸出物50 mL，1 moL·L-1MgSO42 mL。其中，ASP+N：氯化鉀2.61 g，磷酸二氫鉀7.48 g，硝酸鈉29.75 g，pH 5.5，加蒸餾水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min；CM Trace elements：ZnSO4·7H2O 2.1 g，H3BO31.1 g，MnCl2·4H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g，CoCl2·6H2O 0.17 g，CuSO4·5H2O 0.16 g，Na2MoO4·2H2O 0.15 g，EDTA 5.1 g，ddH2O定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)：蒸餾水900.7 mL，121 ℃滅菌20 min。加入50%甘油10 mL，K buffer 0.8 mL，0.01% FeSO410 mL，MN buffer 20 mL，1% CaCl2·2H2O 1 mL，1 moL·L-1MES 40 mL，IM Trace elements 5 mL，20% NH4NO32.5 mL，20%葡萄糖10 mL。其中，K buffer：KH2PO4(1.25 mol·L-1)17.01 g加蒸餾水定容至100 mL；K2HPO4(1.25 mol·L-1)21.77 g加蒸餾水定容至100 mL;將K2HPO4加入到KH2PO4中并調(diào)節(jié)pH至4.8，121 ℃滅菌20 min。MN buffer：MgSO4·7H2O 3 g，NaCl21.5 g，蒸餾水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min。IM Trace elements：ZnSO4·7H2O 10 mg，CuSO4·5H2O 10 mg，H3BO310 mg，MnSO4·H2O 10 mg，Na2MoO4·2H2O 10 mg，加蒸餾水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中20%葡萄糖5 mL，添加瓊脂粉15 g·L-1。

黑曲霉液體培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 1 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，酵母浸出物10 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至4.0，115 ℃滅菌20 min。

黑曲霉草酸發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，ZnCl20.001 g·L-1，MnSO4·5H2O 0.014 g·L-1，(NH4)2SO43 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.01 g·L-1，MES 0.5 mol·L-1，調(diào)節(jié)pH至4.0，115 ℃滅菌30 min。

基本培養(yǎng)基(MM)：無機(jī)鹽溶液 20 mL，D-葡萄糖10 g·L-1，乙酰胺10 mmol·L-1，定容至1 L。其中無機(jī)鹽溶液：KCl 26 g，MgSO4·7H2O 26 g，KH2PO476 g，微量元素溶液50 mL，加蒸餾水定容至1 L；微量元素溶液：Na2B4O7·10H2O 40 mg，CuSO4·5H2O 400 mg，F(xiàn)ePO4·2H2O 800 mg，MnSO4·2H2O 800 mg，Na2MoO4·2H2O 800 mg，ZnSO4·7H2O 8 g，加蒸餾水定容至1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1黑曲霉基因組DNA的提取 收集相應(yīng)菌株的菌絲體，用蒸餾水洗滌2～3次后經(jīng)液氮研磨至粉狀，取約200 mg粉末于2 mL EP管中，加入950 μL的DNA提取緩沖液(NaCl 100 mmol·L-1，EDTA 50 mmol·L-1，SDS 1%，Tris 50 mmol·L-1，pH 8.5)重懸并于65 ℃下放置30 min。加入350 μL 5 mol·L-1的醋酸鉀振蕩混勻，于-20 ℃下靜置15 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心，取1 mL上清液并加入等體積苯酚混合物，劇烈混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心，收集水相并逐滴加入350 μL異丙醇，4 ℃ 12 000 r·min-1離心收集沉淀基因組DNA。

1.2.2基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI中構(gòu)巢曲霉amdS表達(dá)盒序列，分別設(shè)計(jì)上下游引物P1055/P1056，以構(gòu)巢曲霉基因組DNA為模板擴(kuò)增amdS表達(dá)盒序列。PCR體系：模板DNA 1 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1)1 μL，2×Phanta Max buffer 25 μL，引物各 2 μL，Phanta Max 1 μL，ddH2O 18 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸3 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，得到3 368 bp的DNA序列。

以黑曲霉ATCC1015基因組DNA為模板，以P953/P954為引物分別擴(kuò)增oahA的上游片段，以P955/P956為引物擴(kuò)增oahA的下游片段。PCR體系：模板DNA 2 μL，引物各 2 μL，Premix 25 μL，ddH2O 19 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，分別得到1 025 和1 049 bp的DNA序列。

以黑曲霉ATCC1015基因組DNA為模板，以P816/P817為引物擴(kuò)增含有其自身啟動(dòng)子的oahA基因表達(dá)盒序列。PCR體系：模板DNA 1 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1)1 μL，2×Phanta Max buffer 25 μL，引物各 2 μL，Phanta Max 1 μL，ddH2O 18 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，得到2 457 bp的DNA序列。

1.2.3敲除質(zhì)粒和回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建 以本課題組pLH334作為出發(fā)載體，利用KpnⅠ/EcoRⅠ分別雙酶切pLH334質(zhì)粒和amdS表達(dá)盒序列片段，將pLH334上的ble篩選標(biāo)記替換為amdS，得到新的基因敲除出發(fā)質(zhì)粒pLH439。

將擴(kuò)增的oahA上游片段(1 025 bp)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切回收后，連接到pLH439質(zhì)粒得到含有oahA上游片段的質(zhì)粒pLH440；再將擴(kuò)增得到的oahA下游片段(1 049 bp)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切回收后，連接到pLH440質(zhì)粒的SpeⅠ/HindⅢ酶切位點(diǎn)，得到包含oahA基因上下游片段的基因敲除質(zhì)粒pLH453。

以pLH331作為出發(fā)載體，利用EcoRⅠ/BamHⅠ分別酶切pLH331質(zhì)粒和oahA表達(dá)盒序列片段(2 457 bp)，經(jīng)T4連接酶連接重組后獲得oahA基因表達(dá)回補(bǔ)質(zhì)粒pLH372。

1.2.4農(nóng)桿菌的電轉(zhuǎn)化 將相應(yīng)重組質(zhì)粒與農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合后放入2 mm電擊杯中，設(shè)置電壓2.5 kV，電容25 μF，電阻率200 Ω，脈沖5 ms進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。然后迅速加入預(yù)冷的1 mL LB培養(yǎng)基，28 ℃，150 r·min-1培養(yǎng)6 h，取100 μL涂于含100 μg·mL-1卡那霉素的LB固體平板上，2 d后隨機(jī)挑選圓形米白色單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選

將農(nóng)桿菌單菌落接種于3 mL含有100 μg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)液經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min，菌體沉淀轉(zhuǎn)接至5 mL的IM液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，取農(nóng)桿菌與黑曲霉孢子1∶1混合液400 μL緩慢滴加到鋪有0.45 μm濾膜的IM平板上，待風(fēng)干后，將平板放置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。加入0.6 mL無菌水將濾膜上的菌體洗滌下來，轉(zhuǎn)移至含有100 μg·mL-1氨芐霉素、100 μg·mL-1鏈霉素、200 μg·mL-1頭孢噻肟鈉、250 μg·mL-1潮霉素B的CM平板上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取單菌落接至含有250 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板和含有10 mmol·L-1乙酰胺的MM平板中。根據(jù)需要表型挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.6抗性篩選標(biāo)記hph的切除 為切除轉(zhuǎn)化子中的潮霉素B抗性篩選標(biāo)記基因hph，收集相應(yīng)菌株的孢子(約200個(gè))涂布于含有30 μg·mL-1多西四環(huán)素的MM固體平板上培養(yǎng)5 d。多西四環(huán)素誘導(dǎo)Cre表達(dá)，位于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的hph將被重組切除。將長(zhǎng)出的重組子分別點(diǎn)接在PDA培養(yǎng)基和含有250 μg·mL-1潮霉素B的PDA上，選取在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的克隆，提取其基因組DNA，以引物對(duì)P607/P608擴(kuò)增hph基因。

1.2.7黑曲霉生長(zhǎng)表型分析 為了考察黑曲霉轉(zhuǎn)化子對(duì)乙酰胺的利用情況，分別將黑曲霉野生型菌株S304、含有amdS表達(dá)盒的黑曲霉轉(zhuǎn)化子S665以及構(gòu)巢曲霉菌株S478點(diǎn)接于含不同氮源的MM平板上。其中A培養(yǎng)基是含1%葡萄糖，0.2%硝酸銨和12 mmol·L-1CsCl的MM固體培養(yǎng)基，B培養(yǎng)基是含1%葡萄糖，10 mmol·L-1乙酰胺和12 mmol·L-1CsCl的MM固體培養(yǎng)基。28 ℃培養(yǎng)3～5 d后觀察菌體生長(zhǎng)情況。

為考察黑曲霉ΔoahA菌株及回補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)情況，分別點(diǎn)接黑曲霉野生型菌株S304、ΔoahA菌株S668和oahAΔoahA菌株S430于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d后觀察菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)孢情況。

1.2.8黑曲霉中oahA基因表達(dá)水平分析 點(diǎn)接相應(yīng)菌株于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4～5 d長(zhǎng)出足量新鮮孢子后向平板中加入3 mL無菌水，用棉簽輕輕摩擦菌體表面，收集孢子。孢子懸液經(jīng)Miracloth濾布過濾后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。以2×106個(gè)·mL-1的孢子濃度接種于50 mL黑曲霉草酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1震蕩培養(yǎng)3 d，12 000 r·min-1離心2 min，收集菌絲體并用無菌濾紙吸干，液氮研磨后提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA。設(shè)計(jì)引物P1002/P1003，分析黑曲霉ΔoahA菌株和oahA回補(bǔ)菌株中oahA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。以P992/P993為引物，肌動(dòng)蛋白基因act1作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 1 μL，相應(yīng)引物各0.4 μL，Taq1.6 μL，ddH2O 14.5 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸23 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。

1.2.9黑曲霉中草酰乙酸水解酶活性分析 收集在黑曲霉草酸發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3 d的菌絲體，利用10 mmol·L-1的pH 7.0的磷酸鉀緩沖液清洗三次。取約0.5 g菌體經(jīng)液氮冷凍后研磨，粉末中加1 mL細(xì)胞蛋白提取緩沖液(0.1 mmol·L-1的MnCl2，50 mmol·L-1β-巰基乙醇，7%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))蔗糖，20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)于0 ℃懸浮，12 000 r·min-1離心5 min后取上清液，用于總蛋白和酶活檢測(cè)。胞內(nèi)總蛋白的測(cè)定遵循標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍(lán)法，草酰乙酸水解酶酶活測(cè)定以草酰乙酸為底物，檢測(cè)酶解后乙酸的生成量[13]。

1.2.10菌體干重和草酸產(chǎn)量測(cè)定 以2×106個(gè)·mL-1孢子濃度接種于50 mL黑曲霉草酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)3 d。期間每天取樣，4 ℃、12 000 r·min-1離心2 min，收集上清液并進(jìn)行適度稀釋。將1 mL稀釋液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，使用安捷倫1260系列高效液相儀檢測(cè)發(fā)酵液中草酸濃度。色譜檢測(cè)條件：HPX-87H(Bio-Rad)有機(jī)酸柱，流動(dòng)相：5 mmol·min-1H2SO4，流速：0.6 mL·min-1，柱溫度65 ℃，UV 210 nm，檢測(cè)時(shí)間15 min。同時(shí)，收集的菌絲體經(jīng)蒸餾水洗滌2次后，于105 ℃干燥至恒重，計(jì)算菌體干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉在含乙酰胺培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

為了考察黑曲霉在含乙酰胺培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，將野生型黑曲霉S304接入兩種不同的培養(yǎng)基(圖1)后發(fā)現(xiàn)，在含0.2%硝酸銨的MM培養(yǎng)基A中長(zhǎng)出少量孢子，而在含10 mmol·L-1乙酰胺和12 mmol·L-1CsCl的MM培養(yǎng)基B中菌體不生長(zhǎng)，無明顯菌絲和孢子產(chǎn)生。而含amdS表達(dá)盒的黑曲霉轉(zhuǎn)化子S665在B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常，且生長(zhǎng)明顯比出發(fā)菌株S304迅速。同時(shí)，構(gòu)巢曲霉S478可以在含有乙酰胺的MM培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，這與先前報(bào)道一致[8-9]。因此，可以利用amdS基因作為黑曲霉轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記。

A：含1%葡萄糖，0.2%硝酸銨和12 mmol·L-1 CsCl；B：含1%葡萄糖，10 mmol·L-1乙酰胺和12 mmol·L-1 CsCl。

2.2 黑曲霉oahA敲除菌株中amdS篩選標(biāo)記分析

將敲除載體pLH453通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆，與黑曲霉孢子進(jìn)行共培養(yǎng)。從圖2可以看出，amdS表達(dá)盒位于oahA上下游同源片段的外側(cè)，當(dāng)發(fā)生同源重組時(shí)，amdS被重組丟失而失去利用乙酰胺的能力，而位于oahA上下游片段之間的loxP-hph-loxP賦予菌體在含有潮霉素B培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力。將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子編號(hào)，依次轉(zhuǎn)接至含有250 μg·mL-1潮霉素B的PDA抗性平板和含有10 mmol·L-1乙酰胺的MM篩選平板上。在挑取的41個(gè)轉(zhuǎn)化子中，17號(hào)和21號(hào)轉(zhuǎn)化子在含有潮霉素B的PDA平板上可以生長(zhǎng)，而不能在含有乙酰胺的MM平板上生長(zhǎng)(圖2A)。因此，可初步判定這兩株菌株為oahA敲除菌株。將17號(hào)和21號(hào)轉(zhuǎn)化子提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證分析。根據(jù)雙交換的原理設(shè)計(jì)驗(yàn)證敲除的引物(圖2C)，若oahA被成功敲除，以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，以P973/P974及P975/P976為引物擴(kuò)增不出條帶，而由于潮霉素B編碼基因的存在，以P973/P641及P642/P976為引物則可以擴(kuò)增出條帶，同時(shí)以P973/P976為引物，擴(kuò)增得到的片段比野生型菌株基因組為模板得到的片段長(zhǎng)300 bp。其中，轉(zhuǎn)化子17號(hào)與oahA敲除菌株預(yù)期情況一致，oahA敲除成功，命名為S668(圖2C)。由此可知，利用此轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的概率約為2.4%。

A：oahA基因敲除轉(zhuǎn)化子在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況,紅框所示為敲除轉(zhuǎn)化子；B：oahA基因敲除結(jié)構(gòu)；C：黑曲霉ΔoahA菌株P(guān)CR結(jié)果，M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；WT：黑曲霉野生型菌株S304；S668：oahA敲除轉(zhuǎn)化子。

2.3 oahA回補(bǔ)菌株構(gòu)建及分析

利用包含oahA表達(dá)盒的回補(bǔ)質(zhì)粒pLH372轉(zhuǎn)化無hph抗性篩選標(biāo)記的ΔoahA菌株，質(zhì)粒中的loxP-hph-loxP賦予宿主菌體在含有潮霉素B培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力(圖3A)。為進(jìn)一步將潮霉素篩選標(biāo)記刪除，將所得轉(zhuǎn)化子孢子涂布于含有30 μg·mL-1四環(huán)素的MM平板上，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后挑取轉(zhuǎn)化子于PDA平板上，第2 d將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子對(duì)應(yīng)點(diǎn)接至含有250 μg·mL-1潮霉素B的PDA抗性平板上，選擇在PDA上生長(zhǎng)而在潮霉素抗性平板上不生長(zhǎng)的克隆，其中第24號(hào)轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證后為正確的oahA回補(bǔ)菌株，命名為S430(圖3B)。同時(shí)，將黑曲霉野生型菌株S304，ΔoahA菌株S668和oahAΔoahA菌株S430接種于PDA培養(yǎng)基觀察菌株的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)三株菌的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢能力無顯著差異(圖3C)。

A：oahA回補(bǔ)S668生長(zhǎng)情況；B：oahAΔoahA菌株S430生長(zhǎng)情況,紅框?yàn)榛匮a(bǔ)菌株S430；C：三種菌株在PDA培養(yǎng)基上生產(chǎn)情況對(duì)比。

2.4 oahA基因?qū)Σ菟岷铣傻挠绊?/h3>

2.4.1不同菌株中oahA轉(zhuǎn)錄及酶活水平的變化

為了考察oahA基因在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)草酸中表達(dá)情況，S304、ΔoahA菌株S668和S430接種于黑曲霉草酸發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，收集菌絲體，提取總RNA后通過RT-PCR檢測(cè)oahA基因在草酸發(fā)酵中的表達(dá)情況。如圖4A所示，黑曲霉野生型菌株S304和oahAΔoahA菌株S430中，oahA基因均高水平表達(dá)，而ΔoahA菌株S668中無oahA基因表達(dá)。同時(shí)對(duì)三株菌中草酰乙酸水解酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株S304(0.16 U·mg-1)相比，ΔoahA菌株S668中未檢測(cè)到草酰乙酸水解酶活性，而oahA回補(bǔ)菌株S430中草酰乙酸水解酶比酶活則恢復(fù)到野生型的水平(0.21 U·mg-1)(圖4B)。

A：反轉(zhuǎn)錄PCR分析oahA在不同菌株中的轉(zhuǎn)錄情況；B：不同菌株中草酰乙酸水解酶酶活性測(cè)定。

2.4.2不同菌株合成草酸水平分析 為了考察oahA基因敲除后黑曲霉草酸產(chǎn)量的變化，通過HPLC方法對(duì)黑曲霉發(fā)酵液進(jìn)行分析(圖5A)。結(jié)果顯示，黑曲霉野生型菌株S304草酸產(chǎn)量為10.3 g·L-1，而oahA基因敲除菌株S668為0.87 g·mL-1，草酸產(chǎn)量顯著下降，回補(bǔ)oahA基因后，草酸產(chǎn)量恢復(fù)到野生型水平(圖5B)。同時(shí)在此發(fā)酵過程中，三種菌體干重沒有顯著差異(圖5C)。

3 討論

黑曲霉作為一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株在有機(jī)酸和酶制劑生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用，然而對(duì)其遺傳學(xué)研究還不充分。由于可用于黑曲霉轉(zhuǎn)化體系的遺傳篩選標(biāo)記有限，通過黑曲霉的遺傳改造提升工業(yè)菌種生產(chǎn)性能步伐緩慢。構(gòu)巢曲霉中的amdS基因編碼一種乙酰胺酶，對(duì)于該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制已做了詳細(xì)研究[8-9]，并且利用該基因先后在構(gòu)巢曲霉[14]、玉米病原菌異旋孢腔菌[15]、產(chǎn)黃青霉菌[16]、納地青霉[17]、米曲霉[18]和其他黑曲霉菌株[3,19]等多種絲狀真菌中建立起遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在黑曲霉中并不存在amdS的同源基因。通過研究發(fā)現(xiàn)，野生型黑曲霉菌株在以乙酰胺為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良，而amdS表達(dá)盒則賦予了其生長(zhǎng)能力(圖1)。這為在黑曲霉中構(gòu)建以amdS為篩選標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了可能性。本文以構(gòu)巢曲霉中的amdS基因表達(dá)盒構(gòu)建了黑曲霉基因敲除出發(fā)質(zhì)粒pLH439，當(dāng)通過同源重組發(fā)生基因敲除時(shí)，因amdS表達(dá)盒被丟失而喪失在乙酰胺為唯一氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力(圖1和圖2)。黑曲霉中草酰乙酸水解酶oahA是檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)中草酸的主要來源，通過構(gòu)建的以amdS為篩選標(biāo)記的基因敲除系統(tǒng)，成功地篩選到ΔoahA黑曲霉菌株。ΔoahA黑曲霉菌株菌體生長(zhǎng)能力無顯著變化(圖3)，而草酸合成水平顯著降低(圖5)，由此證明以amdS為篩選標(biāo)記的黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系成功建立，且在構(gòu)建草酰乙酸水解酶敲除菌株過程中，利用該系統(tǒng)獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的概率為2.4%。amdS篩選標(biāo)記的引入大大提高了篩選效率，減少了實(shí)驗(yàn)工作量。同時(shí)amdS為一種營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記，在食品、藥品生產(chǎn)用菌株的改造中有顯著優(yōu)勢(shì)，這為理性高效改造黑曲霉菌株提供了有力工具。

A:通過HPLC方法分析黑曲霉發(fā)酵液中草酸含量(紅色箭頭所指位置即為草酸，保留時(shí)間為6.6 min)；B:不同菌株在草酸產(chǎn)量；C:發(fā)酵過程中菌體干重的變化。